La ricerca biomedica sta affrontando una crisi di riproducibilità in quanto i nuovi risultati della ricerca sono raramente tradotti in applicazioni terapeutiche. Questo protocollo riduce il fattore umano e introduce l'automazione e la standardizzazione nella produzione. Questo metodo si concentra specificamente sugli idrogel fotocollegabili per applicazioni di coltura cellulare 3D poiché gli idrogel sono diventati la piattaforma più utilizzata nel cancro e in altri modelli di tessuto patologico nell'ultimo decennio.
Abbiamo affrontato con successo le attuali limitazioni hardware e software con lo sviluppo di una piattaforma tecnologica open source. Questa piattaforma è stata specificamente progettata per gli idrogel e consente flussi di lavoro di produzione automatizzati per la ricerca sull'ingegneria tissutale. Per installare l'API, aprire l'interfaccia della riga di comando.
Per installare l'API di lavoro, inserisci pip install openworkstation e premi Invio. Per utilizzare il modulo di bio fabbricazione del pipettaggio, immettere il comando per installare l'API opentrons. Quindi usa la riga di comando per aprire uno script Python e verificare se entrambe le API sono state installate correttamente.
Per generare il codice di protocollo, aprire l'applicazione di progettazione del protocollo per generare uno script di protocollo personalizzato che verrà eseguito dalla piattaforma. L'interfaccia funziona su tutti i browser Internet comunemente usati. Immettere il nome del protocollo nella pagina di configurazione e fare clic su Continua.
Nella configurazione del vassoio di alimentazione, selezionare il blocco di riscaldamento tre per quattro per definire il vassoio di alimentazione. Per definire i materiali e le concentrazioni di stock, selezionare Gel 1 dal menu Definisci input e immettere GelMA come nome. Impostare la concentrazione di stock su 20% e il numero di campioni su tre e fare clic su Aggiungi per salvare le voci e riempire la prima colonna.
Selezionate Gel 2 dal menu Definisci ingressi e immettete Alginato come nome. Impostare la concentrazione di stock su 4% e il numero di campioni su tre e fare clic su Aggiungi per salvare le voci e riempire la seconda colonna. Dopo aver impostato i parametri del fotoiniziatore e del diluente come dimostrato, selezionare la reticolazione delle foto, impostare il tempo su 30 secondi e l'intensità su due e fare clic su OK. Quindi, impostare il tipo di piastra del pozzo su piastra del pozzo 96 e fare clic su Gruppo 1 per consentire di specificare i parametri per la creazione di idrogel a doppia rete.
Quindi selezionare la casella Applica protocollo di miscelazione avanzato, se necessario, impostare il numero di campioni su 96 e fare clic su Continua. Per impostare il layout del mazzo, selezionare il tipo di vassoio appropriato per ogni slot. Quando tutti i tipi di vassoio sono stati selezionati, fare clic sulla casella di sinistra della pipetta e selezionare lo spostamento positivo da 10 a 100 microlitro dal menu a discesa.
Impostare la velocità di aspirazione su 600 e la velocità di erogazione su 800. Quindi impostare i parametri corretti della pipetta nello stesso modo. Quindi fare clic su Genera protocollo per generare e salvare lo script del protocollo.
Prima di eseguire il protocollo, spruzzare i materiali di consumo con etanolo al 70% e posizionarli in base alla configurazione definita nella configurazione dell'utente. Posizionare i tubi di reazione con i materiali nel blocco di alluminio sui dock di temperatura in base alla configurazione selezionata. Quindi, spruzzare i guanti con etanolo al 70% e aprire attentamente i tubi di reazione senza toccare i tubi aperti.
Quando le sostanze hanno raggiunto la temperatura sperimentale appropriata, eseguire il protocollo generato utilizzando l'interfaccia utente. La postazione di lavoro inizierà con il processo di homing, seguito dall'ottenimento di una piastra di pozzo vuota dal modulo di archiviazione. Dopo aver rimosso il coperchio dalla piastra del pozzo, la piastra viene trasportata al modulo successivo.
Il protocollo specifica il volume da pipettare da ciascuna soluzione madre e modifica automaticamente le punte dopo ciascun materiale per evitare contaminazioni incrociate. Per miscelare soluzioni viscose in modo riproducibile, la workstation esegue un protocollo di miscelazione specifico che è stato ottimizzato per idrogel viscosi. L'app di progettazione del protocollo tiene conto del livello di riempimento del serbatoio e adatta automaticamente l'altezza di miscelazione per evitare inutili immersioni nei materiali viscosi.
Dopo la generazione automatica di modelli 3D e piastre di pozzo, la postazione di lavoro chiude nuovamente la piastra del pozzo con il coperchio e memorizza la piastra del pozzo nella posizione programmata nel modulo di stoccaggio. Una volta terminato il protocollo, rimuovere la piastra dal modulo di archiviazione. Per la convalida e la verifica del protocollo condotto, caricare la piastra su uno spettrofotometro e leggere l'assorbanza due volte a 450 nanometri.
Dopo aver salvato i valori di assorbanza, aprire il foglio di calcolo di analisi fornito come materiale supplementare nella pubblicazione e copiare le letture di assorbanza nella tabella nella scheda tecnica grezza. Quindi fare clic sul foglio di analisi per visualizzare i valori medi, la deviazione standard e il coefficiente dei valori di varianza, che vengono calcolati e visualizzati automaticamente per una distribuzione uniforme del campione per righe specifiche e per colonne specifiche di una piastra a 96 pozzetti. Per trovare il setup che garantisce un'elevata riproducibilità delle soluzioni di glicerolo, sono stati generati protocolli senza controllo della temperatura e senza tip touch, con controllo della temperatura e senza tip touch, o con controllo della temperatura e con tip touch.
Il coefficiente calcolato dei valori di variazione per le tre configurazioni ha rivelato un'influenza significativa del dock di temperatura e della funzione tip touch, evidenziando la capacità del protocollo di generare risultati altamente riproducibili quando si utilizzano entrambe le funzionalità. Utilizzando la funzione tip touch con il dock di temperatura, la deviazione standard è stata significativamente ridotta nella configurazione tre. Il tracciato dei valori di assorbanza del campione per la configurazione tre non ha prodotto valori crescenti o decrescenti durante l'esperimento e quindi non ha indicato alcuna influenza della posizione del campione sui valori di assorbanza.
Successivamente, è stata preparata una serie di diluizioni GelMA diluendo una soluzione madre GelMA al 20% e valutando le differenze tra le diverse diluizioni GelMA. Il valore di assorbanza misurato in ogni fase di concentrazione era significativamente diverso e la regressione lineare ha dimostrato un elevato adattamento confermando la capacità di generare fasi di concentrazione distinte. Inoltre, l'influenza del tocco della punta è stata valutata per idrogel a doppia rete con 5% GelMA, 2% alginato e 0,15% LAP, che sono stati generati automaticamente con la configurazione.
L'integrazione del tip touch si traduce in una significativa diminuzione della deviazione standard che supporta la generazione di un set di dati riproducibile. La visualizzazione dei valori di assorbanza e delle mappe termiche ha confermato la deviazione ridotta quando si utilizza il tocco della punta per rimuovere il materiale in eccesso dalla punta. La nostra tecnologia consente l'automazione della fabbricazione di idrogel per la coltura cellulare 3D e l'ingegneria tissutale.
Si tratta di una soluzione a basso costo per aumentare il throughput e la riproducibilità di flussi di lavoro tecnicamente impegnativi. Fornendo un approccio open source personalizzabile, questa tecnologia apre la strada all'adattamento diffuso dell'automazione dei processi nella ricerca sull'ingegneria tissutale.
