Questo protocollo consente la quantificazione dell'area, del perimetro e della forma della struttura intracellulare dalla sua immagine bidimensionale. Questa tecnica è semplice e veloce, richiede solo impostazioni di laboratorio standard e un microscopio confocale e utilizza software opensource. A dimostrare la procedura sarà Anna Balcerak, dottoranda del mio laboratorio.
Inizia seminando quattro volte 10 alla quinta cellule in 0,5 millilitri di mezzo di coltura per pozzo in uno scivolo a camera rivestita di collagene a quattro po po 'per una coltura di 24 ore in un incubatore di anidride carbonica di 37 gradi Celsius e cinque gradi. La mattina seguente, utilizzare un microscopio ottico invertito per verificare la presenza di almeno il 90% di monostrato confluente e utilizzare un microscopio confocale per ottenere singole immagini a z-slice. Per l'analisi dell'adesione focale, aprite le immagini in ImageJ e selezionate analizza, impostate la scala, rimuovete la scala e globali per impostare la scala dell'immagine in pixel.
Per includere il nome del file e l'area dell'area di interesse nelle opzioni di misurazione, fare clic su analizza e imposta misurazioni e controllare l'area e visualizzare le opzioni dell'etichetta. Per sottrarre lo sfondo, selezionare il processo e sottrarre lo sfondo. Impostare il raggio della palla rotolante su 50 pixel e controllare il paraboloide scorrevole.
Per determinare l'area della regione di interesse più piccola, delineare la più piccola adesione focale singola e fare clic su analizza e misura per misurare l'area. Quando sono state selezionate e misurate almeno 20 regioni di interesse, calcolare e salvare la media dei risultati ottenuti. Impostare il limite superiore sul 25% di un'area di cella tipica.
Per conferire l'immagine al binario, fare clic su immagine, regolare e soglia e controllare lo sfondo predefinito, bianco e nero e scuro. Per misurare il numero e le aree delle aree di interesse, selezionare analizza e analizzare le particelle e controllare le unità di pixel, visualizzare i risultati, cancellare i risultati e riepilogare. Trasferire i dati relativi alla dimensione media della sezione, del conteggio e dell'area totale dalla finestra di riepilogo al programma di gestione dei dati preferito.
Per la quantificazione dell'adesione focale, aprire la macro ImageJ di adesione focale ed entrare nell'area della regione di interesse più piccola come area della più piccola regione di interesse. Impostare il valore del tipo di soglia su manuale o automatico e salvare le modifiche. Quindi chiama la macro da ImageJ e seleziona l'immagine da elaborare.
Per l'analisi manuale della forma delle celle, aprire un'immagine in un programma software di elaborazione delle immagini appropriato e selezionare i parametri da misurare. Utilizzare lo strumento di selezione a mano libera per delineare manualmente i bordi delle celle contrassegnati dalle proteine di giunzione scelte. I parametri scelti verranno calcolati automaticamente per ogni cella.
Dopo aver delineato tutte le celle, selezionare Modifica, selezione e aggiunta a Manager. È necessario selezionare solo le celle completamente visibili complete con bordi ininterrotti. Per effettuare la misurazione, contrassegnare tutti i numeri visualizzati nella casella sinistra del gestore dell'area di interesse e fare clic su misura.
I risultati verranno visualizzati nella casella dei risultati e possono essere importati nel foglio di calcolo preferito. L'analisi automatizzata delle cellule facilita la quantificazione del gran numero di cellule. Per ogni nuovo tipo di cella, eseguire innanzitutto la macro per stabilire i parametri.
Al termine della macro, selezionare Imposta limiti dimensioni cella. Fare clic sull'etichetta delle celle più piccole e più grandi e fare clic su misura. Impostare il valore della cella più piccola e delle variabili di cella più grandi e salvare le modifiche.
Chiudere tutte le finestre macro e selezionare l'immagine da elaborare in scala di grigi. Quindi eseguire di nuovo la macro. La macro fornirà una tabella dei risultati che include l'indice della forma della cella, le proporzioni e i dati dell'elenco delle selezioni delle aree di interesse.
Qui, è possibile osservare immagini rappresentative delle aderenze focali contate con ImageJ, inclusi i contorni numerati finali e le sovrapposizioni dei contorni dell'adesione focale con l'immagine originale sia per le linee cellulari di controllo che knockdown. Come illustrato in questa analisi, le cellule knockdown hanno dimostrato un numero maggiore di aderenze per cella e aderenze di dimensioni maggiori rispetto alle celle di linea cellulare di controllo. In queste immagini vengono mostrate regioni rappresentative di monostrati cellulari non trattati e trattati chemioterapici.
Le cellule contorno sono state caratterizzate in base ai loro valori di indice della forma cellulare, ad esempio in questa analisi che mostra un aumento dell'ultimo contenitore e un appiattimento dei picchi principali per le cellule trattate con farmaci rispetto ai controlli non trattati. Una distribuzione di frequenza e una distribuzione cumulativa potrebbero quindi essere generate per ogni coltura cellulare. L'imaging in scala di grigi dei monostrati come dimostrato ha permesso l'analisi e la quantificazione di 512 cellule da 12 campi visivo rivelando una distribuzione relativa della frequenza dell'indice della forma cellulare.
Affinché questo protocollo funzioni, è importante utilizzare immagini della migliore qualità possibile. Una corretta semina cellulare, colorazione e imaging dovrebbero garantire immagini di qualità sperimentale sufficiente.
