Il nostro protocollo è ottimizzato per il modello di mouse e utilizza materiali prontamente disponibili per tutti gli investigatori. Questa tecnica può essere applicata a modelli di topo sani, disease o geneticamente alterati. Il nostro protocollo consentirà agli investigatori di rispondere a qualsiasi domanda sulla biologia dei periciti cardiaci da qualsiasi modello di malattia o variazione genetica del topo.
Questa procedura fornirà informazioni sulla biologia dei periciti cardiaci e ci aiuterà a comprendere il loro contributo all'omeostasi cardiaca e all'emodinamica sia nella salute che nelle malattie. Posizionare il mouse anestetizzato in posizione supina e rastrettare gli arti anteriori. Aprire con cura la cavità toracica e cannulate l'aorta discendente usando un ago a farfalla calibro 25.
Fai un graffio nell'atrio destro. Quindi, perfondere il cuore con almeno 20 millilitri di 250 unità per millilitro eparinizzato, privo di calcio-magnesio, dulbecco tamponato salina a due millilitri al minuto con una pompa peristaltica a flusso variabile. La perfusione è completa quando il PBS pulito esce dall'atri destro.
Tagliare il cuore all'aorta e posizionarlo nel DPBS privo di calcio-magnesio ghiacciato. Quindi, trasferisci il cuore in una piastra di Petri di 15 per 15 centimetri. Tagliare il cuore a pezzetti usando forbici a molla e forcep a punta fine con una soluzione enzimatica sufficiente a coprire i pezzi.
Ora, trasferire i pezzi e la soluzione in un tubo conico da 50 millilitri e sigillare con pellicola di plastica paraffina. Incubare a 37 gradi Celsius su uno shaker orbitale a 120 giri/min per 75 minuti. Dopo la digestione della collagenasi con la soluzione enzimatica, decantare il liquido attraverso un colino cellulare da 100 micron in un nuovo tubo da 50 millilitri, lasciando una soluzione sufficiente in modo che i pezzi non si asciughino.
Utilizzando forcep a punto fine, prendere il tessuto dal tubo e posizionare alcuni pezzi su uno scivolo al microscopio. Quindi, macinare il tessuto tra due vetrini del microscopio per rompere il tessuto. Risciacquare le diapositive con mezzi di coltura senza enzimi in un nuovo tubo conico da 50 millilitri.
Ripetere questo passaggio fino a quando tutti i pezzi di tessuto non vengono dissociati. Unire la soluzione tesa e il tessuto macinato in un unico tubo. Filtrare la sospensione risultante attraverso un filtro cellulare da 100 micron in un nuovo tubo conico da 50 millilitri.
Centrifugare il campione a 220 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Aspirare la soluzione precedente e rimpignare delicatamente il pellet cellulare in tampone di colorazione FACS freddo contenente DPBS e albumina di siero bovino. Contare le celle e verificare la vitalità utilizzando un contatore di celle.
Diluire le cellule a un milione di cellule per millilitro con tampone di colorazione FACS freddo contenente DPBS e albumina di siero bovino. Le celle sono ora pronte per essere macchiate e ordinate. Preparare ed etichettare tubi FACS da cinque millilitri per tutti i controlli e campioni di cellule.
Aliquota di un millilitro di celle per tubo per un campione non macchiato, fluorescenza meno un controllo e controlli abbinati all'isotipo. Utilizzare le celle rimanenti per l'ordinamento. Tutti i controlli e i campioni possono essere preparati e macchiati contemporaneamente.
Inoltre, preparare ed etichettare tubi FACS a cinque millilitri per un totale di nove controlli di compensazione, due tipi di perline non macchiate più sette diversi fluorocromi dal pannello marcatore. Per ottimizzare i controlli di compensazione della fluorescenza, aggiungere una goccia di perline di compensazione dalla fiala di compressione a ciascun tubo. Quindi, aggiungere un microlitro di anticorpo alle perline.
Ripetere per ogni anticorpo dal pannello marcatore. Utilizzare i controlli FMO per ottimizzare la colorazione dello sfondo a causa della sovrapposizione spettrale. Alle cellule nei tubi di controllo FMO, aggiungere tutti gli anticorpi dal pannello marcatore a una diluizione uno-a-100, ma escludere un anticorpo.
Ripetere per ogni anticorpo per un totale di sette controlli. Utilizzare anticorpi di controllo abbinati all'isotipo per la colorazione non specifica. Alle cellule nei tubi etichettati abbinati all'isotipo, aggiungere l'anticorpo di controllo abbinato all'isotipo a una diluizione uno-a-100.
Preparare quindi le celle da ordinare. Alle cellule appena isolate, aggiungere un cocktail di anticorpi a una diluizione uno a 100. Inoltre, aggiungere il colorante di vitalità cellulare a una diluizione uno-a-1.000.
Mescolare vigorosamente i controlli di compensazione con il vortice a impulsi. Incubare per 30 minuti a quattro gradi Celsius, protetti dalla luce, ad eccezione delle perline di vitalità cellulare, che possono essere lasciate a temperatura ambiente, protette dalla luce. Mescolare delicatamente i controlli FMO, i controlli abbinati all'isotipo e le celle da ordinare per vortice di impulsi.
Incubare per 30 minuti a quattro gradi Celsius, protetti dalla luce. Aggiungere tre millilitri di buffer di colorazione FACS a ciascun controllo di compensazione, controllo FMO e controllo isotipo. Centrifugare i tubi a 300 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Aspirare la soluzione e rimospendare ogni pellet in 400 microlitri di tampone di colorazione FACS. I controlli di compensazione, i controlli FMO e i controlli isotipo sono ora pronti per essere utilizzati. Dopo la colorazione, lavare le cellule con tampone di colorazione FACS per centrifugazione a 300 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Aspirare la soluzione e resospendare il pellet cellulare nel tampone di colorazione FACS a 0,5 milioni di cellule per millilitro. Utilizzando nuovi tubi FACS con piani filtranti da 35 micron, pipettare i campioni di celle macchiate sui coperchi e filtrare la gravità per ottenere sospensioni a cella singola. Tieniti sul ghiaccio.
Utilizzare uno smistatore di celle per purificare le celle. Eseguire le celle non macchiate sullo smistatore di celle per impostare tensioni e correggere il segnale di fondo. Eseguire ogni campione di perline di compensazione a singolo colore uno alla volta per regolare le tensioni per ogni canale e regolare i cancelli per il segnale positivo.
Raccogliere i dati. Utilizzare il software per calcolare la sovrapposizione spettrale calcolando la matrice di compensazione. Tutte le tensioni sono pronte e impostate.
Eseguire ogni controllo isotipo uno alla volta. Questi dati possono essere utilizzati per regolare i gate per l'associazione non specifica, se presente. Eseguire ogni campione FMO uno alla volta.
Regolare le tensioni per ogni canale per correggere la smarrimento spettrale grazie a un pannello multicolore. Eseguire i campioni di celle macchiate nello smistatore di celle. Raccogli le cellule in mezzi di coltura senza enzimi da 10 millilitri in un tubo di raccolta conico da 15 millilitri.
Utilizzare la seguente strategia gating. In primo luogo, cancello per singole celle. Quindi, cancello per le cellule vive.
Quindi, gate per le celle NEGATIVE CD45. Gate per celle CD34 e CD31-negative. Quindi, cancello per le cellule NG2-positive.
E infine, gate per le cellule cd146 e CD140b-positive. Per coltura dei periciti, seminare le cellule appena ottenute in mezzi di coltura senza enzimi su una piastra rivestita da 24 potte. Coltura delle cellule in un incubatore di cellule impostato a 37 gradi Celsius, 5% anidride carbonica e 95% ossigeno.
Dopo la digestione enzimatica e la dissociazione di tutto il cuore e prima della purificazione FACS delle cellule, le cellule sono una miscela grezza che contiene molti tipi di cellule diverse dal cuore. Dopo la purificazione e la coltivazione facs, le cellule sono omogenee. Sono nucleati singoli, abbastanza piatti e hanno la tipica morfologia romboide pericite.
Utilizzando FACS, le cellule vengono purificate all'omogeneità. In primo luogo, detriti e doppietti sono stati recintati in base alle distribuzioni di dispersione avanti e laterale. Quindi, le cellule morte sono state recintate a causa della loro reazione ammina con il colorante, che produce un segnale maggiore e più intenso delle cellule vive.
Delle cellule vive, le cellule ematopoietiche sono state gated out essendo cd45-positive. Per rimuovere ulteriormente le cellule ematopoietiche ed endoteliali, le cellule CD34-positive e CD31-positive sono state gated out. Infine, le cellule NG2-positive e CD140b/CD146-positive sono state selezionate per essere cellule perivascolari con espressione di marcatori periciti tipici.
Rispetto ai periciti cerebrali umani, le cellule avevano una morfologia simile. Rispetto alle cellule muscolari lisce del topo e dell'uomo, le cellule avevano una diversa caratterizzazione fenotipica morfologica delle cellule al passaggio sette per immunocitochimica per marcatori di periciti che non mostravano cambiamenti osservati nella morfologia o nell'espressione marcatore. Allo stesso modo, l'analisi per citometria del flusso dei periciti al passaggio sette confermò che la popolazione rimase omogenea.
La vitalità cellulare è fondamentale per ottenere una buona resa. Mantenere i tessuti freddi durante l'approvvigionamento e mantenere le celle fredde durante la colorazione cellulare. Inoltre, assicurarsi che la soluzione enzimatica sia preparata fresca ogni volta.
Per garantire l'isolamento delle cellule corrette dopo la coltazione, caratterizzarle con citometria a flusso e colorazione immunofluorescente. Queste cellule possono essere utilizzate in esperimenti di cocoltura con cellule endoteliali per studi di barriera funzionale, nonché test per studiarne la funzione e le caratteristiche biologiche e fisiologiche. I periciti cardiaci svolgono un ruolo fondamentale nell'integrità e nella stabilità vascolare e la loro disfunzione è consequenziale alla funzione cardiaca globale.
Con la nostra tecnica, i ricercatori possono esplorare il potenziale terapeutico dei periciti cardiaci.
