Questo protocollo consente l'acquisizione simultanea di più embrioni all'interno di una sessione di imaging. Mentre la preparazione del campione è adattata per l'acquisizione multi-punto utilizzando un analizzatore ad alto contenuto, i campioni preparati utilizzando questo protocollo possono essere immagini su qualsiasi microscopio invertito in grado di acquisizione multi-punto. Per iniziare, organizza due file da 15 a 20 embrioni su una sezione pulita di grande piatto usando uno strumento di selezione delle uova.
Allineare gli embrioni sul loro lato ventrale nello stesso orientamento rispetto alle estremità anteriore e posteriore. Aderire a un distanziale su un coverslip e striare 10 microlitri di colla eptano lungo l'inserto in vetro coverslip esposto. Mentre la colla si asciuga, usa una lama di rasoio per tagliare un rettangolo intorno alle due file di embrioni.
Tagliare un secondo rettangolo accanto al primo e rimuovere il secondo rettangolo con un lato dritto di una spatola in acciaio inossidabile. Far scorrere con cura il bordo dritto della spatola sotto il primo rettangolo e rimuoverlo. Quindi, posizionare il ritaglio con embrioni sul lato esterno di un piatto di 3,5 centimetri.
Al microscopio stereo, abbassare un coverslip preparato sugli embrioni e premere delicatamente le due file di embrioni sulla colla. Se non si esegue la microiniezione, riempire il distanziale in silicone a metà strada verso l'alto con olio di alocarbonio uno-a-uno da 700 a olio di alocarbonio 27. Allineare i bordi inferiori di un adattatore a piastra a quattro diapositive con nastro fronte-doppio.
Ciò impedirà alla diapositiva di muoversi durante l'imaging. Assicurarsi di non posizionare il nastro nel percorso dell'obiettivo. Montare il coverslip sull'adattatore a quattro vetrini.
Se si microiniettano gli embrioni, posizionare il coverslip con embrioni su uno scivolo per evitare che il fondo del coverslip si sporchi durante l'essiccazione e la microiniezione. Essiccare gli embrioni per cinque-10 minuti, quindi coprirli immediatamente con olio di alocarbonio uno-a-uno 700 all'olio di alocarbonio 27, riempiendo il distanziale in silicone a metà strada verso l'alto. Caricare due o tre aghi di microiniezione con circa due microlitri di iniettore utilizzando una punta di carico estesa.
Montare un ago sul microiniettore e deprimere lo stantuffo a metà della punta, aumentando la pressione dell'aria all'interno del capillare di vetro. Abbassare l'ago di vetro su uno scivolo di vetro e tagliare la punta dell'ago con un nuovo rasoio numero nove, tagliando con un angolo di 45 gradi per produrre una punta aperta affilata. L'iniettore dovrebbe scorrere verso il basso della punta senza scorrere fuori dall'ago.
Aggiungere con cura 20 microlitri di olio di alocarbonio sulla punta dell'ago e tagliarlo di nuovo aperto con un angolo di 45 gradi. L'iniettore dovrebbe iniziare a fluire rapidamente, quindi ricorda di regolare la pressione ritraendo lo stantuffo. Utilizzare il micromanipolatore per posizionare l'ago al centro del campo visivo.
Quindi sollevare l'ago e rimuovere lo scivolo di vetro da sotto di esso. Posizionare gli embrioni sullo stadio del microscopio stereo, sotto l'ago di microiniezione e concentrarsi su di essi a 50 volte l'ingrandimento. Abbassare l'ago fino a quando non entra nello stesso piano di messa a fuoco degli embrioni.
Spostando la diapositiva con una mano e operando il microiniettore con l'altra, iniettare una fila di embrioni. Sollevare l'ago e ruotare lo scivolo di 180 gradi per esporre la seconda fila di embrioni all'ago di microiniezione. Abbassare l'ago e iniettare la seconda fila di embrioni.
Questo protocollo è stato utilizzato per esaminare il ruolo dei microtubuli nella riorganizzazione del reticolo endoplasmatico durante la mitosi nell'embrione Drosophila. Gli effetti di diversi trattamenti farmacologici microiniettati sulla riorganizzazione del ER sono stati confrontati quantitativamente. La colchicina, che impedisce la nuova polimerizzazione dei microtubuli, è stata trovata per ridurre drasticamente la localizzazione del ER ai poli del mandrino durante la mitosi.
Sono stati acquisiti dati di imaging time lapse per 32 embrioni. Le misurazioni della media e dell'intensità massima sono state analizzate da 12.800 regioni di interesse utilizzando uno script MATLAB personalizzato. Quando si tenta questo protocollo per la prima volta, ricordarsi di non richiedere troppo tempo su un solo passaggio, altrimenti si rischia di perdere la fase di sviluppo che si desidera immagini.
Esercitati passo dopo passo con questo protocollo prima di tentare qualsiasi esperimento. Il nostro metodo di preparazione del campione facilita l'acquisizione simultanea di più embrioni durante un esperimento, generando così abbastanza repliche sperimentali per l'analisi quantitativa. Questo protocollo può aiutare la transizione dell'embriologia dello sviluppo da esperimenti di imaging qualitativi a esperimenti di imaging quantitativo.
La possibilità di immaginare più embrioni all'interno di una sessione di imaging elimina anche il rumore sperimentale tra le repliche.
