Questo lavoro è stato supportato da una borsa di ricerca Wellcome Trust Senior I. Davis.

1. Drosophila preparazione preliminare per la dissezione (Secondo E. Gavis, Princeton University) <ol><li> Eliminare gli adulti da una bottiglia poco seminati e trasferire il flacone a 25 ° C in anticipo del vostro esperimento. Una volta che nuovi adulti hanno cominciato ad emergere, aspettare due giorni. </li><li> Prendete un flacone contenente circa 10 ml fly di cibo solido e aggiungere 0,5-0,7 grammi di lievito secco (vedi tabella) su un angolo di 45 gradi. Non coprire l&#39;intera superficie del cibo mosca con il lievito. </li><li> Aggiungere poche gocce d&#39;acqua per il lievito, sufficiente per idratare (Figura 1A). Posizionare il flacone a 45 gradi e consentire circa 3 minuti per il lievito di assorbire l&#39;acqua (Figura 1B). </li></ol> Nota: In alternativa, premiscela un lievito pasta in un contenitore separato e aggiungere la pasta alla fiala con una spatola. <ol start="4"><li> Anestetizzare le mosche nel flacone iniettando CO 2 gas. Quando si interrompe il movimento, punta le mosche inconsci sul CO 2 </sub&gt; pad fly per l&#39;ordinamento (Figura 1C). </li><li> Isolare 10-15 femmine e 5 maschi del genotipo desiderato in un ambito dissezione con un pennellino a punta di vernice (Figura 1D). I maschi sono evidenti dalla presenza di appendici, una struttura scuro sporgente, a loro posteriore. </li><li> Aggiungi mosche selezionati al flaconcino yeasted (Figura 1E). Posto a 25 ° C per 24-60 ore. Incubare per periodi di tempo più brevi per una percentuale maggiore di giovani nelle camere a metà stadio di uova e periodi di tempo più lunghi per camere di ritardo stadio di uova. </li></ol> 2. Drosophila dell&#39;ovaio dissezione <ol><li> Mettere una piccola goccia di olio su un alocarburo No. 1.5, 22 x 50 coprioggetto mm (Figura 2A). Impostare la slittamento preparato coperchio sul lato dove non sarà in modo. </li><li> Anestetizzare le mosche in vile yeasted iniettando CO 2 gas e punta su un CO 2 pad. </li><li> Utilizzare taglienti fine-naso pinze per afferrare un individuo ingrassato femminile la parte anteriore dell&#39;addome (non tra the addome e torace) (Figura 2B-C). </li><li> Tenere la femmina con le pinze e visualizzare sotto un microscopio da dissezione, circa 2-3 cm sopra il vetrino preparato. </li><li> Sempre tenendo al anteriore, utilizzare una seconda serie di pinze per rimuovere il tessuto alla estrema posteriore della femmina (Figura 2D). Nota: il tessuto Gut di solito tirare fuori con l&#39;estremità posteriore. Pulire il tessuto rimosso dalle pinze. </li><li> Mentre ancora in mano la femmina al anteriore, utilizzare le pinze spazzato per spremere delicatamente o massaggiare l&#39;addome, lavorando anteriore verso la parte posteriore. Massaggiare l&#39;addome nello stesso modo come la rimozione dentifricio dalla estremità di un tubo. </li><li> Due grandi strutture opache sarà spinta con l&#39;addome e bastone sulla estremità della pinza (Figura 2E-F). Queste sono le ovaie accoppiati. </li><li> Toccare le ovaie sul Halocarbon nella diapositiva seguente. </li><li> Ripetere la dissezione 1-2 volte per un totale di 4-6 ovaie nell&#39;olio sul coprioggetto (Figure 2G). </li></ol> 3. Ovarioles isolamento Nota: Ogni ovaio contiene circa 16 ovarioles composte da 6 a 10 camere uovo di diverse fasi disposte come perle di una collana 10. Nota: prima di isolare il ovarioles, regolare la sorgente luminosa sul microscopio da dissezione modo che l&#39;illuminazione colpisce con un angolo piccolo al campione. Questo dà contrasto con il campione e consente la visualizzazione delle camere giovani stadio di uova. <ol><li> Nel olio, separare le due ovaie rimuovendo il tessuto connettivo all&#39;estremità posteriore (stadi vecchi) con pinza chiusa (Figura 3A). </li><li> Orient un ovaio individuo con le più antiche fasi alla sinistra del palco e il più giovane a destra. I giovani camere stadio di uovo nelle ovaie sono trasparenti e costituiscono la fine più appuntita delle ovaie. </li><li> Con un paio di pinze in mano dominante, afferrare delicatamente il posteriore di un ovaio, preferibilmente con i resti del the tessuto connettivo. Tenendo l&#39;ovario in posizione con le pinzette, utilizzare una sonda dissezione (o ago di tungsteno) per prendere in giro fuori ovarioles individuali (Figura 3B-D). </li></ol> Nota: ovarioles individuali si romperà tra le fasi di giovani (germarium di mettere in scena 10), gli stadi più vecchi sono troppo grandi per essere separato dal ovaio pieno. Nota: si fora un ovocita in ritardo palco con la sonda dissezione si tradurrà in perdite nel citoplasma l&#39;olio e fare l&#39;estrazione di singoli ovarioles molto impegnativo. Se un ovocita fase avanzata viene forato, passare a un ovaio fresco. <ol start="4"><li> Una volta che il ovariole è libero dell&#39;ovaio, utilizzare la sonda dissezione per trascinare al centro della goccia di olio e orientare l&#39;orientamento desiderato per l&#39;esperimento. Nota: Ovarioles in olio si sistemerà e aderire al vetro. </li><li> Ripetere questo processo (3,3-3,4) fino a quando ci sono 15-25 ovarioles individuali. Nota: Questo può richiedere la dissezione di multipLe ovaie. L&#39;intero processo dovrebbe prendere meno di 15 minuti. </li></ol> Nota: Si consiglia di sezionare un ovaio ciascuno da mosche diverse, piuttosto che sezionare entrambe le ovaie da un minor numero di mosche per aumentare il numero n di mosche per l&#39;esperimento. Nota: la gestione approssimativa della ovariole si tradurrà in ovociti sani e può portare ad artefatti nell&#39;esperimento. Nota: Gli oociti inizieranno a visualizzare i cambiamenti fenotipici dovuti a stress 40 minuti dopo essere stato sezionato dall&#39;ovaio (confronta 7E figura a F). <ol start="6"><li> Una volta ovarioles sono in un orientamento adeguato (Figura 3E), utilizzare la sonda e la dissezione pinza chiusa per spostare eccesso di tessuto ovarico dal petrolio. Questo materiale può essere cancellato dalla pinza su un tovagliolo di carta. </li></ol> 4. Isolamento dei singoli stadi tardivi camere d&#39;uovo (Secondo E. Gavis, Princeton University) <ol><li> Con una coppia di pinze in Dominant mano, afferrare la parte posteriore di un ovaio isolato, preferibilmente con i resti del tessuto connettivo. Tenendo l&#39;ovario in posizione con le pinze, introdurre la sonda dissezione nell&#39;estremità posteriore dell&#39;ovaio vicino alle pinze (Figura 4A). Evitare la puntura camere a uovo inserendo la sonda tra le camere tardo stadio di uova. </li><li> Estrarre l&#39;ago attraverso la dissezione ovaio finché uscite dei primi camere stadio di uova (Figura 4B). Se fatto correttamente, la sonda verrà rimosso il tessuto connettivo che detiene le ovarioles e tardo camere stadio di uova in atto. </li><li> Ripetere il punto 4.2 fino alla ovarioles sono steso sul vetrino. Nota: Quando camere uova non sono più impilati uno sopra l&#39;altro, questo passaggio è completo. </li><li> Utilizzando la sonda dissezione, separare gli ovociti fine di consentire un facile per l&#39;imaging (Figura 4C). </li></ol> Nota: Puntura un ovocita, mentre la dissezione fine camere stadio di uova non è come una condanna come con i dissezioneovarioles ndividual per i più giovani stadi. Nota: Per stage 14 camere d&#39;uovo, usare le pinze per afferrare le appendici dorsali per l&#39;orientamento. 5. Iniezione di preparazione Nota: Per l&#39;iniezione degli ovociti stadio metà, orientare il ovarioles perpendicolarmente all&#39;asse longitudinale del coprioggetto. <ol><li> Accendere il microscopio di imaging [nel nostro caso un Core DeltaVision da Applied Precision] e caricare le impostazioni di imaging appropriate (Figura 5A-B). </li><li> Accendere il dispositivo di iniezione (Figura 5C). </li><li> Caricare l&#39;ago per iniezione con una punta di carico (Figura 5D-E). Le soluzioni da iniettare deve essere centrifugati brevemente ad alta velocità per evitare depositi che potrebbero bloccare l&#39;ago di iniezione. </li><li> Applicare l&#39;ago caricato iniezione all&#39;iniettore. Fare attenzione per evitare di rompere l&#39;ago (Figura 5F). </li><li> Per assistere con aghi unclogging, mettere un piccolo pezzo di vetro, 2x10 millimetri da un taglio o rottura di un vetrinot un lato della goccia olio contenente i ovarioles. Assicurarsi che questo frammento di vetro coperti di olio. Questo vetro servirà a ram la punta dell&#39;ago contro per la rottura di stasare l&#39;ago. </li></ol> 6. Iniezione di fluorescenza dell&#39;RNA Prima di iniziare: Sistemare il dispositivo di iniezione e micro-manipolazione di tali controlli che l&#39;ago per l&#39;iniezione è posizionata sopra il centro del campo visivo. <ol><li> Montare il campione da iniettare sul microscopio scena. </li><li> Selezionare l&#39;obiettivo 20x. Obiettivi di ingrandimento superiori o inferiori possono anche essere utilizzati. </li></ol> Nota: Se si utilizza una fase automatizzata con possibilità di visitare il punto è consigliabile segnare tutta la fase di 8-9 ovociti per l&#39;iniezione prima di cominciare. Ciò consente un facile e per visitare iniezione di ovociti selezionati. <ol start="3"><li> Abbassare l&#39;ago di iniezione fino a toccare l&#39;olio. Centrare la punta dell&#39;ago sulla lente dell&#39;obiettivo. </li><li> Girarespegnere le luci in camera e accendere la luce in campo chiaro per il microscopio. Selezionare il primo punto (ovocita) sulla lista marcato punti. Mentre si guarda attraverso gli oculari, concentrarsi su l&#39;ovocita (Figura 6A). </li><li> Abbassare l&#39;ago manualmente fino a che è nello stesso piano di messa a fuoco come l&#39;oocita e visibile successivo l&#39;uovo. </li><li> Utilizzando i controlli manipolatore, spostare il punto di iniezione dell&#39;ago finché è all&#39;interno del ovocita. Un movimento veloce accoltellamento è spesso più successo di un progresso lento. Una volta all&#39;interno, espellere un piccolo volume dall&#39;ago e valutare visivamente gli effetti, ripetere come richiesto. Se l&#39;iniezione è riuscita, il citoplasma all&#39;interno dell&#39;ovocita sarà spostato, se ciò non sia evidente, ripetizione. Non è necessario immagine in fluorescenza per determinare se il materiale è stato iniettato. Dopo l&#39;iniezione, rimuovere l&#39;ago dall&#39;interno l&#39;ovocita (Figura 6B-G). </li><li> L&#39;esatta quantità di fluido iniettato è difficile quantificare. Per aumentare il volume iniettato, regost la pressione o il tempo dell&#39;impulso di iniezione, rompere la punta dell&#39;ago per aumentare l&#39;apertura leggermente o utilizzare impulsi di iniezione ripetute. </li></ol> Nota: Il processo di iniezione intero dovrebbe richiedere meno di 10 secondi quando viene eseguito correttamente. Ampia lancinante o persistente, con l&#39;interno ago per ovocita provocherà gravi danni alla camera di uovo. <ol start="8"><li> Prima di selezionare il successivo ovocita marcata, sollevare l&#39;ago di iniezione ad alta abbastanza nell&#39;olio per non entrare in contatto oociti altri nel percorso di viaggio. </li><li> Al ovocita nuovo, ripetere il punto 6.6. Proseguire in questo modo fino a che tutti gli ovociti necessari vengono iniettati. </li></ol> Nota: Se viene commesso un errore durante l&#39;iniezione, passare al successivo ovocita segnato. Non perdere tempo su ovociti danneggiati. Nota: L&#39;ago può ostruirsi nel corso di una sessione di iniezione. In questo caso, spostare l&#39;ago adiacente al pezzo di vetro rotto nell&#39;olio sul vetrino. Spiritoh il vetro e l&#39;ago nello stesso piano focale, delicatamente ariete l&#39;ago nel bicchiere (Figura 6H). Verificare che l&#39;ago è unclogged premendo il pulsante di iniezione e vedere se il liquido esce dalla punta dell&#39;ago. <ol start="10"><li> Quando tutti gli oociti sono stati iniettati, spostare manualmente l&#39;ago, dall&#39;olio e orientarla fuori del percorso del fascio per il microscopio. Assicurarsi che sia in un orientamento sicuro, per evitare danni agli occhi. </li></ol> Nota: Se un lungo periodo di tempo trascorso tra l&#39;isolamento delle uova da camera e l&#39;iniezione degli ovociti, ovociti sarà difficile da iniettare ed esporre cambiamenti fenotipici associati a stress. Problemi simili possono sorgere con la gestione approssimativa del ovocita o iniezione di volumi in eccesso (confrontare 6I figure, J, K). 7. Live disegno sperimentale di imaging <ol><li> Selezionare la ovocita prima iniettato dalla lista. Test che l&#39;iniezione era dentro l&#39;ovocita per immagini un fotogramma in fluorescenza (as in Figura 6G). </li><li> Configurare i parametri sperimentali, tra cui: lunghezza d&#39;onda di eccitazione, percorso emissione, tempo di eccitazione, Z-stack e il tempo tra le collezioni. Nota: per ulteriori informazioni su questo, vedere Parton R., et al. (2010) 2. </li><li> Raccogliere il set di dati. </li></ol> 8. Risultati rappresentativi In vitro sintetizzato Alexa-546 Grk RNA iniettata in un Me31B :: GFP uovo camera (Figura 7A). L&#39;RNA localizza anteriore dorsale dell&#39;ovocita e forma un tappo attorno al nucleo (Figura 7B). Per ulteriori esempi di localizzazione di RNA vedere MacDougall N., et al. (2003) 11. Ovociti stadio metà e alla fine esprimono proteina fluorescente marcato (Tau-GFP, Figura 7C) o sistemi di tagging RNA (GRK * mCherry, Figura 7D) può essere ripreso senza iniezione. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig1.jpg" /> Figura 1. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig2.jpg" /> Figura 2. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig3.jpg" /> Figura 3. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig4.jpg" /> Figura 4. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig5.jpg" /> Figura 5. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig6.jpg" /> Figura 6. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig7.jpg" /> Figura 7.

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Non abbiamo nulla da rivelare.

<html> Imaging cellulare Live è un potente test per l&#39;esame processi cellulari in tempo reale. Oltre a semplice osservazione campo luminoso, l&#39;aggiunta di etichette fluorescenti per proteine ​​e RNA di interesse ha portato a molte innovazioni. Qui abbiamo delineato un protocollo di ovociti viventi imaging individuali che possono essere utilizzati in combinazione con analisi genetiche e biochimiche. In questo protocollo, spieghiamo anche come manipolare sperimentalmente ovociti viventi mediante iniezione. Ci sono molte possibilità per materiale da iniettare, anche in vitro sintetizzato fluorescenti RNA etichettati per saggiare la capacità di una struttura secondaria di RNA diretta localizzazione (Ball e Davis, inedito) e gli anticorpi che inibiscono la funzione delle proteine ​​6. I lavori futuri si potrebbe vedere l&#39;introduzione di componenti di etichettatura e altri macchinari cellulare di ovociti di vita che consentano meccanismi molecolari da testare. t &quot;&gt; Preservare la vitalità e la salute del tessuto è essenziale quando si lavora con cellule vive. In questo protocollo, si segnala una serie di passi che possono portare allo stress della camera di uovo. Ad esempio, nonostante l&#39;olio essere superiore per l&#39;imaging, cultura estesa nell&#39;olio, possono generare stress sulla camera uovo. Questo può essere facilmente monitorato in condizioni di esposizione campo chiaro esaminando la morfologia nucleare e la posizione, la membrana dell&#39;ovocita che distorcere e bleb sotto stress (cfr. Figura 7E (non accentata) a Figure7F ( sottolineato)). Fase 9 camere uovo mostrano la localizzazione di RNA e la migrazione delle cellule oltre confine 12 ore più. Tuttavia, una fase 7/8 da camera uovo inizierà a mostrare effetti negativi in olio di carbonio halo dopo circa 40 minuti di ovaio viene rimosso dal di sesso femminile. tardo camere d&#39;uovo, Stadio 11 a 14, può svilupparsi normalmente in petrolio o mezzi acquosi causa della secrezione del guscio d&#39;uovo dalle cellule del follicolo in queste fasi 13. E &#39;stato repoRIPO che l&#39;aggiunta di insulina per mezzo acquoso insetto può mantenere fase 9 ovociti fino a 6 ore e 14 germaria fino a 14 ore 15. In tutti i casi, manovra aggressiva della camera uovo deve essere evitata, come sottolinea gli ovociti e riduce la sua redditività. Imaging meno camere d&#39;uovo e avendo cura di trattare ciascuno è delicatamente il modo migliore per garantire la redditività ottimale.

Strumenti utilizzati in dissezione deve essere pulita, ma non hanno bisogno di essere sterilizzati in autoclave. Pulire gli strumenti con EtOH e lasciarli asciugare prima di cominciare. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Belle pennello a punta (Artisti Sable, rotondo, dimensione 00 o 0) </td><td> Disponibile dalle prese d&#39;arte la maggior parte delle forniture </td><td></td><td> Un pennello di buona qualità è importante </td></tr><tr><td> Halocarbon Products Corporation, Serie 95 </td><td> Halocarbon Products Corporation, 887 Kinderkamack Road, River Edge NJ 07661 </td><td></td><td> Distributore europeo: Solvadis (GMBH) Assicurati di ossigenare facendo gorgogliare aria attraverso l&#39;olio. </td></tr><tr><td> Coprire slip-No. 1,5, 22 x 50 millimetri </td><td> International-No1-VWR Cat = 631-0137-22-50 millimetri </td><td> Menzel-Glaser-22-40mm MNJ-400-070T </td><td></td></tr><tr><td> Dumont No.5 - Dumostar </td><td> Strumenti di Scienza Fine </td><td> 11253-20 </td><td> &quot;Biologie&quot; punta è anche un bene, ma più fragile </td></tr><tr><td> Dissezione sonda </td><td> Strumenti di Scienza Fine </td><td> 10140-01 </td><td></td></tr><tr><td> Dissezione microscopio </td><td> Olimpo </td><td> SZ61 </td><td></td></tr><tr><td> CO2 pad </td><td> Disponibile attraverso <a href="http://www.flystuff.com">http://www.flystuff.com</a> / (Una divisione di Genesee Scientific) </td><td> 59-114 (789.060 Dutscher) </td><td> Distributore europeo: www. dutscherscientific. com</a> / E &#39;anche relativamente facile da costruire su misura i vostri pattini propri mosca </td></tr><tr><td> KIMCARE </td><td> Kimbery Clark-KIMCARE-Medical salviette </td><td> KLEW3020 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio-DeltaVision </td><td> Applied Precision </td><td> DC-CORE </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipolatore </td><td> Burleigh Micromanipolatori dalla Lumen Dynamics Group inc. 2260 Argentia Road, Mississauga, Ontario, L5N 6H7 Canada </td><td> Burleigh PCS-5000 serie TS-5000-300 </td><td> <a href="http://www.ldgi-burleigh.com">http://www.ldgi-burleigh.com</a> / (Formerly Exfo) </td></tr><tr><td> Iniezione apparecchi </td><td> Tritech Research, Inc. 2961 Veteran Ave Los Angeles, CA 90064 </td><td> Minj-1 </td><td> Modificato con un titolare a Eppendorf Femptotips </td></tr><tr><td> Ago per iniezione </td><td> Eppendorf sterile Femtotips I e II </td><td> 930000043 </td><td> Diversi suggerimenti sono migliori per le diverse applicazioni </td></tr><tr><td> Caricamento suggerimenti 20μl </td><td> Eppendorf </td><td> 5242956.003 </td><td></td></tr><tr><td> Lievito secco attivo </td><td> Lievito Fleischmann </td><td> # 2192 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparing individual drosophila egg chambers for live imaging

Imaging cellulare Live è una tecnica importante applicata ad un certo numero di tessuti Drosophila utilizzati come modelli per studiare argomenti come specifica asse, la differenziazione cellulare e organogenesi 1. Corretta preparazione dei campioni sperimentali è cruciale, spesso trascurata, passo. Lo scopo della preparazione è quello di garantire rilevanza fisiologica e di creare le condizioni ottimali di imaging. Per mantenere la vitalità del tessuto, è fondamentale per evitare la disidratazione, ipossia, deterioramento surriscaldamento o terreno 2. La camera di Drosophila uovo è un sistema ben stabilito per esaminare questioni relative, ma non limitata, a patterning corpo, localizzazione mRNA e l&#39;organizzazione del citoscheletro 3,4. Per le camere di uova prime e mid-stage, montaggio in Halocarbon è buono per la sopravvivenza, in quanto permette di libera diffusione di ossigeno, previene la disidratazione e ipossia e ha eccellenti proprietà ottiche per la microscopia. Iminvecchiamento di proteine ​​fluorescenti è possibile mediante l&#39;introduzione di transgeni nella camera di iniezione dell&#39;uovo o fisica di RNA marcati, proteine ​​o anticorpi 5-7. Ad esempio, aggiunta di MS2 costrutti al genoma di animali permette l&#39;osservazione in tempo reale del mRNA nell&#39;oocita 8. Questi costrutti consentono di etichettatura in vivo dell&#39;mRNA attraverso l&#39;utilizzo delle interazioni MS2 circuito batteriofago staminali RNA con la sua proteina di rivestimento 9. Qui, presentiamo un protocollo per l&#39;estrazione delle ovaie e isolare ovarioles individuali e camere uova dalla femmina Drosophila. Per una descrizione dettagliata di Drosophila oogenesi cfr Allan C. Spradling (1993, ristampa 2009) 10.

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Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Il<em&gt; Drosophila</em&gt; Uovo camera è un ottimo modello per studiare i meccanismi di localizzazione mRNA. Al fine di acquisire gli eventi dinamici che stanno alla base dei processi di localizzazione, rapida immagini ad alta risoluzione dei tessuti in vivo è necessario. Qui vi presentiamo un protocollo per la dissezione e l&#39;imaging di campioni dal vivo con un&#39;interruzione minima.

Preparazione individuale Drosophila Egg Chambers per l&#39;imaging dal vivo

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

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Biology

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

19.2K Views.  University of Oxford. Il Drosophila Uovo camera è un ottimo modello per studiare i meccanismi di localizzazione mRNA. Al fine di acquisire gli eventi dinamici che stanno alla base dei processi di localizzazione, rapida immagini ad alta risoluzione dei tessuti in vivo è necessario. Qui vi presentiamo un protocollo per la dissezione e l'imaging di campioni dal vivo con un'interruzione minima.

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Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Vivere Imaging della migrazione cellule gliali nella Eye Disco Drosophila immaginale

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Ricerca

Biologia

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

La preparazione di Drosophila Gli embrioni per Live-Imaging Utilizzando il protocollo goccia

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Vivere Imaging of the Brain Zebrafish embrionali da microscopia confocale

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

This technique exposes the Drosophila embryonic neuromusculature for immunohistochemistry or electrophysiological recording. It is useful for studying early events in neuromuscular development or performing electrophysiology in mutants that cannot hatch.

Raccolta e Preparazione Drosophila Gli embrioni per la registrazione elettrofisiologici e altre procedure

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Immagini dal vivo di Drosophila melanogaster Migrazioni Hemocyte embrionali

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

Immagini dal vivo della motilità cellulare e citoscheletro dei singoli neuroni e cellule della cresta neurale in embrioni di zebrafish

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Preparazione di Sviluppo e degli adulti Drosophila Brains e retina per l&#39;imaging dal vivo

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment of live cells with micron-scale resolution1. Oxygen is one of the most important molecules in the cycle of life. It serves as the terminal electron acceptor of oxidative phosphorylation in the mitochondria and is used in the production of reactive oxygen species. Measurements of oxygen are important for the study of mitochondrial and metabolic functions, signaling pathways, effects of various stimuli, membrane permeability, and disease differentiation. Oxygen consumption is therefore an informative marker of cellular metabolism, which is broadly applicable to various biological systems from mitochondria to cells to whole organisms. Due to its importance, many methods have been developed for the measurements of oxygen in live systems. Current attempts to provide high-resolution oxygen imaging are based mainly on optical fluorescence and phosphorescence methods that fail to provide satisfactory results as they employ probes with high photo-toxicity and low oxygen sensitivity. ESR, which measures the signal from exogenous paramagnetic probes in the sample, is known to provide very accurate measurements of oxygen concentration. In a typical case, ESR measurements map the probe's lineshape broadening and/or relaxation-time shortening that are linked directly to the local oxygen concentration. (Oxygen is paramagnetic; therefore, when colliding with the exogenous paramagnetic probe, it shortness its relaxation times.) Traditionally, these types of experiments are carried out with low resolution, millimeter-scale ESR for small animals imaging. Here we show how ESR imaging can also be carried out in the micron-scale for the examination of small live samples. ESR micro-imaging is a relatively new methodology that enables the acquisition of spatially-resolved ESR signals with a resolution approaching 1 micron at room temperature2. The main aim of this protocol-paper is to show how this new method, along with newly developed oxygen-sensitive probes, can be applied to the mapping of oxygen levels in small live samples. A spatial resolution of ~30 x 30 x 100 &mu;m is demonstrated, with near-micromolar oxygen concentration sensitivity and sub-femtomole absolute oxygen sensitivity per voxel. The use of ESR micro-imaging for oxygen mapping near cells complements the currently available techniques based on micro-electrodes or fluorescence/phosphorescence. Furthermore, with the proper paramagnetic probe, it will also be readily applicable for intracellular oxygen micro-imaging, a capability which other methods find very difficult to achieve.

This protocol describes a method for micron-scale three-dimensional imaging of oxygen concentration in the immediate environment of live cells by electron spin resonance microscopy.

Electron Spin Resonance micro-imaging delle specie dal vivo per la mappatura di ossigeno

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

Imaging verticale di Drosophila Embrioni

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.