Questo protocollo è stato sviluppato attraverso il nostro lavoro all&#39;interno e in collaborazione con i laboratori di Paul Martin e Antonio Jacinto. Ringraziamo il Centro archivi Bloomington per il suo servizio eccellente e la comunità Drosophila per continuare a condividere linee di volare. BS è attualmente finanziata da una sovvenzione BBSRC progetto. WW è finanziato da una borsa di studio Career Development Wellcome Trust.

Preparazione <ol><li> Ottenere adeguate linee di Drosophila contenente un hemocyte specifico GAL4 driver (ad esempio SRP-GAL4 2) e un giornalista geneticamente codificato fluorescenti SUP sotto controllo (ad esempio UAS-GFP). Vola omozigoti per SRP-GAL4, UAS-GMA 3 o CRQ-GAL4, UAS-GFP 4, 5 sono particolarmente utili per scopi di imaging (nb GMA è fuso con la GFP actina dominio di legame moesina), vedi sotto per una discussione di la gamma di GAL4 driver e SUP costruisce disponibili (il Bloomington Archivi Centro contiene una grande varietà). </li><li> Incroci genetici sono tipicamente svolta in modo tale alleli mutanti sono equilibrati con fluorescenti bilanciatori CTG o TTG 6, con GAL4 driver e uas costruisce svolta alternativa cromosomi omologhi. In questo modo è possibile selezionare mutanti omozigoti sulla base di assenza di CTG / TTG associata fluorescenza GFP (questo è avvenuto nella fase 2.11). </li><li> Amplifica le scorte e vola posto in una gabbia che con una piastra di agar succo di mela 7. Le mosche sono necessari almeno due giorni per acclimatarsi alla gabbia che gli embrioni prima di iniziare a sufficienza per essere gettate. In generale twenty vola di ogni sesso dovrebbe essere sufficiente per generare embrioni a sufficienza per l&#39;imaging, ma va notato che le linee differenti hanno differenti gradi di fertilità. Utilizziamo 55 millimetri piastre di Petri che si inseriscono nel fondo di un bicchiere di plastica, forato alla base per consentire il flusso d&#39;aria. I mezzi esatto del prelievo degli embrioni non è importante, ma i tempi sono fondamentali al fine di raccogliere correttamente messo in scena embrioni. </li><li> Raccogliere embrioni da un giorno all&#39;altro piastra di agar succo di mela mantenuta a 25 ° C o da un piatto a tempo. Per questi ultimi ci permettono di solito le mosche porre su una piastra preriscaldata per 4 ore, prima di rimuovere la placca ea metterla a 18 ° C per 15-16 ore prima del montaggio degli embrioni: questo fornisce embrioni da stadio avanzato dal 12 al alla fase 15 di sviluppo. Una piastra durante la notte contiene una maggiore diversità di fasi, ma offre il vantaggio di alti livelli di espressione giornalista fluorescenti ematociti concentrati a causa di un periodo di tempo più lungo a 25 ° C come GAL4-UAS sistema è sensibile alla temperatura. </li></ol> Procedura <ol><li> Sloggiare embrioni dalla piastra di agar succo di mela con una piccola quantità di acqua e una punta morbida pennello. Embrioni sloggiato può essere visto facilmente ad occhio nudo. </li><li> Trasferimento degli embrioni a un filtro cella (Fisher) o fatti in casa basket 7 versando acqua dalla piastra di agar succo di mela nel cesto rinviato un bicchiere per la raccolta acque reflue. </li><li> Ripetere il passo 2,2 finché non siete soddisfatti avete abbastanza embrioni trasferiti dalla piastra di agar succo di mela. </li><li> Lavare gli embrioni in cella di filtro / cestino con acqua. </li><li> Luogo cellula filtro / basket nel coperchio capsula di Petri della piastra di agar succo di mela e aggiungere candeggina abbastanza pulito per sospendere gli embrioni nel filtro cellule / basket. </li><li> Seguire dechorionation degli embrioni in un microscopio dissezione sotto campo chiaro: dechorionation è completa quando le appendici dorsali si sono dissolti, che dovrebbe avvenire entro due minuti. </li><li> Rimuovere celle filtro / cestino embrioni contenenti da la candeggina e lavare con acqua residuo di candeggina. Tutte le tracce di candeggina deve essere rimosso prima di procedere alla fase 2.8. Un trucco per valutare se tutte le candeggina è stato rimosso è quello di cancellare l&#39;acqua residua di colore blu tessuti laboratorio - se non vi è residuo di candeggina il colore blu sarà sbiancato bianco / rosa. </li><li> Asciugare l&#39;acqua residua utilizzando tessuti di laboratorio / mediwipes applicata alla parte inferiore della cellula filtro / basket. </li><li> Mettere una goccia d&#39;acqua in un coperchio di piastra di Petri. Con un pennello fine, raccogliere tutti gli embrioni dechorionated dal cestello embrione e risospendere in la goccia. Accanto a secco gli embrioni aspirando l&#39;acqua con una micropipetta o accuratamente con un panno assorbente laboratorio / mediwipes. </li><li> Una volta che gli embrioni sono stati essiccati, aggiungere una goccia di olio voltalef per coprire tutti gli embrioni. Mettere una seconda goccia d&#39;olio adiacente la goccia contenente gli embrioni. NB: non siamo stati capaci di trovare una sede nel Regno Unito fornitore di olio voltalef; Halocarbon 700 (Sigma), possono essere usati. </li><li> Sotto un microscopio a fluorescenza dissezione selezionare opportunamente messo in scena gli embrioni del genotipo desiderato utilizzando un paio di pinze orologiai (numero 5) da la goccia d&#39;olio. Queste pinze devono essere piegati verso l&#39;interno (Figura 1) al fine di raccogliere gli embrioni senza pungere loro membrana vitellina. Trasferimento degli embrioni selezionati per la goccia d&#39;olio secondo. E &#39;importante che si è in grado di vedere ematociti concentrati fluorescente del microscopio da dissezione in modo da essere in grado di raccogliere buone immagini al microscopio confocale (Figura 2). Noi di solito montare embrioni fase 13/14 alla migrazione immagine laterale ematociti concentrati sulla linea mediana ventrale o stadio 15 embrioniper l&#39;immagine della motilità di ematociti concentrati seguenti dispersione oltre l&#39;embrione. </li><li> Stick due coprioggetti (18x18mm, spessore 1) alla parte inferiore di un Petriperm / Lumox piatto (Sarstedt), con 2 gocce di olio voltalef, lasciando circa 1 cm tra loro (Figura 3), che saranno utilizzati per sostenere un copri posto sopra gli embrioni, per non schiacciarli. Petriperm piatti (diametro 50mm) contengono un idrofobo, gas-permeabile membrana. Troviamo che i piatti diventano più facili da usare una volta che sono stati usati più volte (piatti possono essere puliti con etanolo al 70% e riutilizzati). </li><li> In campo chiaro sul microscopio dissezione, raccogliere gli embrioni selezionati uno ad uno con la pinza piegate e allinearli lato ventrale e parallelamente al bordo del coprioggetto (Figura 3). E &#39;possibile allineare fino a 15 embrioni in questo modo, a seconda della destrezza e la vostra pazienza. E &#39;importante per manipolare gli embrioni delicatamente sia gli embrioni e piatto membrana Petriperm sono fragili e possono essere facilmente rotto. </li><li> Una volta che gli embrioni sono allineati aggiungere una piccola goccia di olio e lasciar diffondere per formare uno strato omogeneo tra le due lamelle. Dopo che l&#39;olio si è diffuso (l&#39;operazione potrebbe richiedere alcuni minuti) verificare che gli embrioni sono ancora in alto lato ventrale. Se gli embrioni sono rotolato leggermente, li riposizionare di nuovo con le pinze. </li><li> Infine, utilizzando una pinzetta (numero 3) posto un coprioggetto (18x18mm, spessore 1) nel corso degli embrioni, che poggiano su due coprioggetto precedentemente aderito. Colla questo coprioggetto al coprioggetto supporta l&#39;utilizzo di smalti per unghie (Figura 3). </li><li> Prendete il piatto Petriperm con embrioni montato al microscopio confocale o grande campo e montare il piatto Petriperm sul palco utilizzando un apposito adattatore. Sia un microscopio in posizione verticale o invertito può essere utilizzato, con l&#39;obiettivo obiettivo di messa a fuoco attraverso il coprioggetto (al contrario attraverso la membrana). </li></ol> Rappresentante dei risultati: Questo protocollo descrive come montare embrioni di Drosophila per l&#39;imaging dal vivo di ematociti concentrati sul lato ventrale dell&#39;embrione. Se fatto correttamente sarà facile per generare sia alambicchi o film di ematociti concentrati. Il fattore determinante è il microscopio usato per l&#39;immagine del ematociti concentrati (in particolare la lente obiettiva), ma la natura delle immagini acquisite dipenderà anche dalle fase di sviluppo, la temperatura gli embrioni sono state sollevate in e le linee GAL4 e scuole universitarie professionali utilizzati. Alti livelli di espressione della proteina fluorescente permetterà ematociti concentrati per essere ripreso con maggiore facilità, quindi è importante essere in grado di vedere ematociti concentrati quando gli embrioni sono in fase di 2,11 del protocollo (figura 2 contiene esempi di ematociti concentrati chiaro all&#39;interno embrioni, scattate con una telecamera montato su un microscopio a dissezione). Numeri quindi aumentato di GAL4 e costrutti UAS permettere un maggiore rapporto segnale-rumore. Inoltre questo riduce la necessità di laser ad alta intensità o tempi di esposizione aumentata quando imaging, che a sua volta permette hemocyte comportamento da seguire per lunghi periodi di tempo. Livelli molto elevati di espressione GFP apparirà dettagli della morfologia hemocyte, in particolare il sottile foglio-come lamelle che circondano il corpo circolare cella (Figura 4A-B). Regioni circolare esclusi GFP rappresentano fagosomi (Figura 4A-C). Simili a dita filopodia può essere visto anche che emergono dal lamelle (Figura 4B). GAL4 due piloti rimangono sufficiente a vedere questi processi (Figura 4C), soprattutto se uno o più è SRP-GAL4 (vedi la discussione), comunque più lenta velocità di scansione o potenza del laser più grande del microscopio confocale può essere richiesto. Come diminuire i livelli di espressione diventa più difficile per l&#39;immagine del sporgenze di ematociti concentrati, tuttavia esso è ancora possibile seguire la migrazione di ematociti concentrati in queste condizioni, come il corpo cellulare resta evidente anche quando sporgenze sono meno chiare (Fig. 4D). Nei primi stadi di sviluppo (fino alla fase 13) ematociti concentrati migrare a stretto contatto l&#39;uno all&#39;altro ed è spesso difficile distinguere le singole celle. Entro la fine della fase 13 ematociti concentrati hanno formato una sola linea lungo la linea mediana ventrale (Figura 5A), quindi, diventando sempre più mobili, migrano lateralmente ai bordi del cordone nervoso ventrale (Figura 5B). Il citoscheletro di actina all&#39;interno della dinamica di sporgenze ematociti concentrati può essere direttamente osservata attraverso l&#39;espressione del GMA (Figura 5C) o ciliegio moesina. Montaggio degli embrioni in questo modo consente lo scambio di gas e previene la disidratazione e gli embrioni rimangono vitali immagini seguenti. Se l&#39;embrione è danneggiato durante il montaggio in genere è ovvio che il contenuto embrione fuga attraverso la sua membrana vitellina. Se un embrione si avvia a disidratarsi allora questo può spesso stato visto da deformazioni della membrana vitellina. Occasionalmente un embrione rotolerà nel corso di un film Timelapse, però questo tende solo ad essere problematico per i film più lunghi tempi. Lastly, montaggio embrioni contemporaneamente dà la sperimentalista le migliori possibilità di ottenere un embrione con l&#39;orientamento ideale per il loro esperimento. <img src="/files/ftp_upload/1696/1696fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Pinza per la manipolazione di embrioni dechorionated. Le punte delle pinze orologiai (dimensione numero 5) devono essere piegati verso l&#39;interno al fine di moda uno strumento per raccogliere gli embrioni come mostrato qui. La superficie esterna della regione piegata è utile anche per manipolare gli embrioni quando si posiziona sulla membrana Petriperm in quanto non in possesso di spigoli vivi che potrebbero perforare l&#39;embrione. <img src="/files/ftp_upload/1696/1696fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Immagini rappresentative di embrioni che darà buoni risultati di immagini dal vivo. Immagini di embrioni dechorionated in olio voltalef (al 2,11 del protocollo) assunto un microscopio a fluorescenza dissezione. Vista laterale dello stadio 13 (A) e lo stadio 15 (B) SRP-GAL4, UAS-GFP; CRQ-GAL4, UAS-GFP embrioni. Vista laterale di uno stadio 15 SRP-GAL4, UAS-GFP / +; CRQ-GAL4, embrione uas-GFP/uas-N17Rac (C) in cui ematociti concentrati non sono riusciti a migrare fuori dalla testa, dimostrando che gli embrioni simile a quando ematociti concentrati non sono evidenti lungo le loro rotte migratorie. Vista laterale di uno stadio 17 SRP-GAL4, UAS-GFP; CRQ-GAL4, UAS-GFP embrione mostra la struttura contorto dell&#39;intestino in questa fase di sviluppo (D), la comparsa di contrazione muscolare impedisce immagini dal vivo di embrioni al di là di questo stadio di sviluppo. Vista ventrale della fase 13 (E) e lo stadio 14 (F) SRP-GAL4, UAS-rosso embrioni stinger che mostra la dispersione di ematociti concentrati con nuclei fluorescente. Osservazione dei ematociti concentrati per fluorescenza in fase 2.11 del protocollo è un prerequisito per ottenere immagini eccellenti; anteriore è a destra per tutte le immagini. <img src="/files/ftp_upload/1696/1696fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Montaggio degli embrioni su un Petriperm / Lumox piatto. Due coprioggetto 18x18mm (spessore 1) sono attaccati alla faccia inferiore del piatto Petriperm utilizzando una piccola goccia d&#39;olio, separate da circa 1 cm, come mostrato. Gli embrioni vengono poi allineati lato ventrale con il loro asse parallelo lungo (antero-posteriore) ai bordi del coprioggetto e coperto con una piccola goccia di olio. Una volta che l&#39;olio si è diffusa di colmare il divario tra le due coprioggetto un coprioggetto terzo (18x18mm spessore 1) si posa delicatamente sulla parte superiore del petrolio coperta di embrioni utilizzando le due coprioggetto precedentemente aderito come un ponte per evitare che gli embrioni vengano schiacciati. Questo vetrino viene poi incollata ai due ponti coprioggetto utilizzando due piccole gocce di smalto. Una volta impostato, gli embrioni possono essere esposte su un microscopio in posizione verticale o invertita con la lente obiettivo di messa a fuoco attraverso i coprioggetti (anziché attraverso la membrana Petriperm). <img src="/files/ftp_upload/1696/1696fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Risultati rappresentativi di immagini dal vivo di ematociti concentrati GFP etichettati. Z-proiezioni di ematociti concentrati sul lato ventrale di un palcoscenico 14 SRP-GAL4, UAS-GFP; CRQ-GAL4, UAS-GFP embrione (AB). (A) è un&#39;immagine ingrandimento inferiore, come utilizzato per monitorare hemocyte migrazioni di sviluppo nei film Timelapse. (B) è un ingrandimento maggiore ancora di ematociti concentrati sulla linea mediana ventrale, che mostrano dettagli della loro morfologia. (C) è un singolo 1 fetta m ematociti concentrati sulla linea mediana ventrale in uno stadio 14 SRP-GAL4, UAS-GFP / +; CRQ-GAL4, UAS-GFP / + embrione, rivelando che il numero di copie inferiore GAL4 driver e SUP costrutti sono anche sufficienti a generare buone immagini. (D) mostra una proiezione-z ematociti concentrati in uno stadio 14 CRQ-GAL4, UAS-GFP embrione. Qui sporgenze hemocyte sono meno evidenti a causa della minore espressione di GFP, ma è ancora possibile fare film e tenere traccia della migrazione hemocyte con questa combinazione di driver e GAL4 UAS costruire. Le immagini sono state scattate in un microscopio confocale Leica LSM510; anteriore è in tutte le immagini, gli anelli alla periferia di immagini sono causati da autofluorescenza membrana vitellina. <img src="/files/ftp_upload/1696/1696fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Risultati rappresentativi di immagini dal vivo di ematociti concentrati GMA esprimere. Z-proiezioni di ematociti concentrati sulla linea mediana ventrale dello stadio 13 (A) e lo stadio 14 (B) SRP-GAL4, UAS-GMA embrioni, presi dai film Timelapse per mostrare le migrazioni di sviluppo di ematociti concentrati. Informazioni dettagliate sulle dinamiche actina può essere ottenuta con l&#39;imaging ingrandimento maggiore di ematociti concentrati GMA esprimere (C). GMA consiste GFP fusa al dominio di legame actina-di filamenti di actina moesina ed etichette. Anteriore è in tutte le immagini, le immagini sono state scattate in un microscopio confocale.

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Gli elementi più importanti di questa procedura sono la selezione di embrioni sani con ematociti concentrati etichettati in modo chiaro e montare con cura senza danneggiarli. Una volta che gli embrioni sono l&#39;olio alocarburi sono resistenti alla disidratazione e una volta montata può essere ripreso per diverse ore. Nelle nostre mani possiamo ematociti concentrati immagine per tre ore, con disidratazione trascurabile dell&#39;embrione o del foto-danno evidente, prendendo un z-pila di immagini ogni tre minuti sul no...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>Cell strainer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352350</td>
<td>70&mu;m pores</td>
</tr>
<tr>
<td>Halcarbon oil 700</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H8898</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lumox/Petriperm dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>96077305</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

live imaging of drosophila melanogaster embryonic hemocyte migrations

Molti studi sulle cellule migrazione indirizzo utilizzando<em&gt; In vitro</emMetodi&gt;, considerando che l&#39;ambiente fisiologicamente rilevanti è quello dell&#39;organismo stesso. Qui vi presentiamo un protocollo per il montaggio di<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Gli embrioni e le successive immagini dal vivo di ematociti concentrati fluorescente, i macrofagi embrionale di questo organismo. Utilizzando il sistema UAS-GAL4<sup&gt; 1</sup&gt; Guidiamo l&#39;espressione di una varietà di geneticamente codificato, marker fluorescente taggato in ematociti concentrati a seguire i loro dispersione di sviluppo in tutto l&#39;embrione. A seguito di raccolta di embrioni allo stadio di sviluppo desiderato, il corion esterno viene rimosso e gli embrioni vengono poi montati in olio alocarburi tra un idrofobo, gas-permeabile membrana e un coprioggetto di vetro per l&#39;imaging dal vivo. Oltre al lordo parametri migratori come la velocità e direzionalità, imaging ad alta risoluzione accoppiato con l&#39;uso di reporter fluorescenti di F-actina e microtubuli in grado di fornire informazioni più dettagliate circa la dinamica di questi componenti del citoscheletro.

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Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Ematociti concentrati Drosophila disperdere sulla totalità dello sviluppo dell&#39;embrione. Questo protocollo dimostra come montare e immagine queste migrazioni uso di embrioni con ematociti concentrati fluorescente.

Immagini dal vivo di Drosophila melanogaster Migrazioni Hemocyte embrionali

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

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Research

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Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

15.6K Views.  University of Bath. Ematociti concentrati Drosophila disperdere sulla totalità dello sviluppo dell'embrione. Questo protocollo dimostra come montare e immagine queste migrazioni uso di embrioni con ematociti concentrati fluorescente.

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Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissezione del sistema nervoso centrale larvali in Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Ricerca

Biologia

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Vivere Imaging of the Brain Zebrafish embrionali da microscopia confocale

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-cell imaging e analisi quantitativa della embrionali in cellule epiteliali Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

Dissezione di Oenocytes da adulti Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolamento di Drosophila melanogaster Testicoli

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, cell differentiation and organogenesis 1. Correct preparation of the experimental samples is a crucial, often neglected, step. The goal of preparation is to ensure physiological relevance and to establish optimal imaging conditions. To maintain tissue viability, it is critical to avoid dehydration, hypoxia, overheating or medium deterioration 2. 
 The Drosophila egg chamber is a well established system for examining questions relating, but not limited, to body patterning, mRNA localization and cytoskeletal organization 3,4. For early- and mid-stage egg chambers, mounting in halocarbon oil is good for survival in that it allows free diffusion of oxygen, prevents dehydration and hypoxia and has superb optical properties for microscopy. Imaging of fluorescent proteins is possible through the introduction of transgenes into the egg chamber or physical injection of labeled RNA, protein or antibodies 5-7. For example, addition of MS2 constructs to the genome of animals enables real time observation of mRNAs in the oocyte 8. These constructs allow for in vivo labeling of mRNA through utilization of the MS2 bacteriophage RNA stem loop interaction with its coat protein 9. 
 Here, we present a protocol for the extraction of ovaries as well as isolating individual ovarioles and egg chambers from the female Drosophila. For a detailed description of Drosophila oogenesis see Allan C. Spradling (1993, reprinted 2009) 10.

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

The Drosophila egg chamber is an excellent model for studying the mechanisms of mRNA localization. In order to capture the dynamic events that underpin the processes of localization, rapid high resolution imaging of live tissue is required. Here, we present a protocol for dissection and imaging of live samples with minimal disruption.

Preparazione individuale Drosophila Egg Chambers per l&#39;imaging dal vivo

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Vivo Imaging delle proteine ​​GFP-etichettati in<em&gt; Drosophila</em&gt; Gli oociti

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Misura della durata della vita in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Vivere Imaging di apoptotica delle cellule libera nel corso<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogenesi

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Imaging attraverso il caso pupa di<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...