This work was supported by Grants-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (26461185 and 25460137).

NOTA: Questo studio è stato approvato dai comitati etici appropriati. 1. Cultura primario umano Polmone fibroblasti <ol><li> Raccolta di tessuto polmonare: <ol><li> Ottenere campioni di tessuto polmonare umano dalla sala operatoria chirurgica direttamente. Raccogliere circa 1 cm 3 isolati da tessuto polmonare cancerose e non cancerose, con il campione non cancerose raccolto più lontano dal tumore possibile. </li><li> Sospendere i campioni in terreno Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) supplementato con 100 unità / ml di penicillina, 100 ug / ml di streptomicina e 0,25 ug / ml di amfotericina B (terreno privo di siero). Mantenere i campioni sospesi in sterili provette da 50 ml e trasferire al laboratorio. NOTA: I fibroblasti sono altamente migratori e proliferative rispetto ad altri tipi di cellule, come le epiteliali, endoteliali e cellule muscolari lisce. Il metodo conseguenza sfrutta queste caratteristiche di fibroblasti, e outgrocellule ala da sezioni di tessuto sono abbondanti in fibroblasti. Dopo diversi passaggi in coltura, altri tipi di cellule non riescono a sopravvivere e propagarsi in DMEM con siero fetale bovino 10% (FBS), risultando in colture cellulari di fibroblasti purificate. Le cellule potrebbero essere usate 3-7 passaggi seguenti colture primarie. </li></ol></li><li> Espianto e condizionamento per escrescenza cellulare: <ol><li> Eseguire colture primarie di fibroblasti con un protocollo precedentemente riportato con modifiche 5. </li><li> In laboratorio, posizionare il campione di tessuto su un piatto di 10 centimetri di coltura tissutale senza terreno di coltura e tagliato in piccole sezioni ~ 2-3 mm di dimensioni con pinza sterile e un bisturi. Durante questo processo, evitare di fare parte asciutta, altrimenti l&#39;efficienza della cella escrescenza è compromessa. </li></ol></li><li> Separazione dello strato di cellule epiteliali e tessuto connettivo: <ol><li> Immergere le sezioni di tessuto tagliato in mezzo di coltura contenente 2.000 PU / ml dispasi I e cultura per 16 ore a 4 ° C. &lt;/ Li&gt; <li> Trasferire le sezioni di tessuto ad un piatto, e separare lo strato di cellule epiteliali dal tessuto connettivo adiacente. Elaborare le sezioni di un banco pulito per evitare la contaminazione di microrganismi. NOTA: Se è necessaria colture primarie di cellule epiteliali, eseguire il passaggio 1.3. Se solo fibroblasti devono essere isolati, omettere il passo 1.3, perché le successive Espianto e cellulari passaggi sono sfavorevoli per le cellule epiteliali, che danno le popolazioni di fibroblasti purificate. </li></ol></li><li> Montaggio di sezioni di tessuto: <ol><li> Tritare i tessuti a pezzi 1 millimetro con due bisturi. Se i pezzi non sono sufficientemente piccoli, spiccano più facilmente dal piatto, e le cellule non riuscirà a superare sulla superficie del piatto. </li><li> Inserire piccole sezioni di tessuto polmonare uno dall&#39;altro per mantenere un&#39;area vuota circostante ogni pezzo. Effettuare graffi sulla superficie del piatto di coltura tissutale con una lama di bisturi per facilitare il fissaggio di sezioni di tessuto. NOTA: Graffioappare anche per facilitare escrescenza cellulare, fornendo piste lungo le quali le cellule possono migrare. <ol><li> In alternativa, inserire pezzi di tessuto tritate individualmente in ogni pozzetto di un 6-pozzetti, e coprire con un vetrino. Fissare il vetrino alla superficie della piastra con grasso al silicone. </li><li> Mettere grasso al silicone in due punti 1,5 centimetri a parte in ogni pozzetto usando un pin sterile. La copertura di pezzi di tessuto migliora l&#39;efficacia di escrescenza cellulare e la propagazione delle cellule dopo diversi passaggi. </li></ol></li></ol></li><li> Successivamente Espianto: <ol><li> Aggiungere delicatamente mezzo di coltura al piatto prima che le sezioni di tessuto asciugano, come conseguenza cella efficiente è perso in gran parte, se i campioni asciugare. Non versare il medium troppo rapidamente come le sezioni di tessuto sarebbe staccare. </li><li> Cellule culturali in DMEM con 10% FBS. Utilizzare abbastanza medio coprire appena il tessuto, ma non troppo che permette galleggiante, come galleggiabilità supplementare promuove distacco dalpiatto. </li></ol></li><li> Brano Cell: <ol><li> Maneggiare il terreno di coltura con cura in ogni momento, come ripetuti movimenti del piatto cultura può portare al distacco delle sezioni di tessuto. </li><li> Porre le capsule di coltura in un incubatore a 37 ° C per 5-7 giorni. Aggiornare il mezzo di ogni altro giorno, e gestire i piatti della cultura minimamente durante le medie modifiche. I fibroblasti troppo grande dal bordo delle sezioni di tessuto nelle prossime settimane. NOTA: Dopo ~ 2-3 settimane, fibroblasti diventano troppo grandi raggiungono quasi confluenza, a seconda della quantità di superficie. </li><li> Lavare le cellule con 1x PBS, e aggiungere 1 ml di tripsina I alla piastra. </li><li> Dopo tripsinizzazione, staccare le cellule utilizzando 9 ml di DMEM supplementato con 10% FBS. Raccogliere cellule sospese nel mezzo in una provetta da 10 ml, insieme alle sezioni di tessuto. Dopo la centrifugazione per formare pellet cellulari, risospendere il pellet con conseguente nuovo mezzo. </li><li> Seed le celle e sezioni di tessuto su un nuovo culpiatto ture, al punto che i tessuti non riescono a collegare al piatto, mentre le cellule aderiscono e crescono. Il giorno seguente, rimuovere i pezzi di tessuto galleggianti per aspirazione, e cambiare il mezzo. Fibroblasti Attached propagano con culture successive. </li></ol></li></ol> 2. tridimensionale Co-cultura umano Polmone fibroblasti e cellule tumorali <ol><li> Preparazione delle cellule e reagenti: <ol><li> Circa utilizzare 2 x 10 5 cellule epiteliali e 2,5 x 10 5 fibroblasti per pozzetto. Preparare collagene di tipo IA (3 mg / ml, pH 3), FBS (100%), tampone di ricostituzione (NaOH 50 mm, 260 NaHCO mM 3, HEPES 200 mm), 5x DMEM, DMEM integrato con il 10% FBS per la cultura di fibroblasti, e un mezzo di co-coltura 3D (una miscela 1: 1 di coltura di fibroblasti medie e terreno di coltura per le cellule tumorali). </li><li> Cultura A549 cellule di adenocarcinoma del polmone, i fibroblasti e la co-coltura A549 3D in DMEM supplementato con 10% FBS. </li></ol></li><li> Collagene gel formazione: <ol><li> Lavare fibroblasti coltivati ​​su 10 centimetri piatto con 1x PBS, e aggiungere 1 ml di tripsina I alla piastra. Dopo tripsinizzazione per ~ 5 min a 37 ° C, staccare le cellule utilizzando 9 ml DMEM supplementato con 10% FBS. Raccogliere cellule sospese nel mezzo in una provetta da 10 ml, e centrifugare a 200-300 xg per formare pellet cellulari. </li><li> Risospendere il pellet risultanti a 100% FBS ad una densità di 5 x 10 5 / ml. </li><li> Preparare il gel di collagene su ghiaccio. Raffreddare i reagenti, pipette e tubi in frigorifero prima della seguente procedura. Anche su ghiaccio, la miscela solidifica in una certa misura, ed il volume totale è inferiore alla somma di tutti i componenti. </li><li> In ogni pozzetto, preparare il gel di collagene miscelando 0,5 ml di sospensione fibroblasti (2,5 x 10 5 cellule) in FBS, 2.3 ml di collagene tipo IA, 670 microlitri DMEM 5x, e 330 microlitri tampone di ricostituzione. Lasciare i gel di impostare facilmente a temperatura ambiente. <ol><li> Vigorosamente pipetta per garantire a mi omogeneaxture. Evitare di creare bolle durante il processo di pipettaggio. </li></ol></li><li> Aggiungere la miscela (3 ml) a ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti e lasciare gelatinizzare in incubatore a 37 ° C senza disturbo per 30-60 min. </li></ol></li><li> Coltura cellulare Cancer sul gel di collagene: <ol><li> Eseguire co-coltura tridimensionale utilizzando un protocollo precedentemente riportato con modifiche 6. </li><li> Risospendere le cellule tumorali nel medio 3D co-coltura (o in DMEM con 10% FBS in caso di cellule A549) ad una densità di 1 x 10 5 / ml. </li><li> Versare 2 ml della soluzione di cellule risospeso (2 x 10 5 cellule) sulla superficie di ciascun gel. Modifica numero di cellule delle cellule tumorali o fibroblasti in co-coltura a seconda delle condizioni sperimentali. </li></ol></li><li> Gel contrazione: <ol><li> Incubare gel notte a 37 ° C in modo che le cellule tumorali possono aderire al gel di collagene. Staccare ogni gel, e generare una &#39;cultura fluttuante&#39; in ogni pozzetto of la piastra da 6 pozzetti. NOTA: utilizzando una cultura galleggiante, vari cambiamenti nella dimensione gel sono indotti dalla tensione meccanica e la degradazione del collagene, che sono mediati da interazioni cellulari tra cellule e fibroblasti tumorali co-coltura. </li><li> Utilizzare un angolato 21 ago G o spatola per separare ciascun gel dal bordo del pozzo. Ogni 2-3 giorni, aggiornare i pozzetti con 2 ml di 3D medio co-coltura. Misurare la dimensione di ciascun gel ogni giorno per 5 giorni. </li></ol></li><li> Analisi di gel di collagene: <ol><li> Misurare il contenuto di collagene di ogni gel con metodi di quantificazione di collagene, come ad esempio il test Sircol. Eseguire l&#39;analisi trascrittomica o RT-PCR dopo aver raccolto RNA da gel 5. </li></ol></li></ol> 3. Aria liquida Cultura Interfaccia e Invasion Assay <ol><li> Dopo coltura i gel di collagene a 37 ° C per 5 giorni, esporre i gel contratte all&#39;aria ponendoli su una maglia (70 micron dimensione dei pori) in una nuova 6-pozzetti. Effettuare la maglia da filtri cellulari disponibili in commercio utilizzati per citometria a flusso. </li><li> Riempire delicatamente ogni pozzetto con 11 ml di 3D medio co-coltura. </li><li> Posizionare il gel sulla rete utilizzando un cucchiaio sterile e rimuovere qualsiasi supporto rimanente dal gel. In questa condizione, immergere gel nel mezzo, mentre esporre la superficie superiore del gel all&#39;aria. Definire questa condizione cultura come interfaccia aria-liquido. NOTA: Dopo 5-7 giorni di mantenimento della coltura interfaccia aria-liquido a 37 ° C in incubatore, le cellule tumorali invasive migrano nel gel. A seconda del tipo di cellula e come risultato di interazioni cellulari, gradi variabili di cellule variazione morfologica nelle cellule tumorali sono indotte dalla cultura all&#39;interfaccia aria-liquido. </li><li> Per la valutazione istologica, fissare il gel in soluzione di formalina notte a temperatura ambiente e incorporare in paraffina. Macchia sezioni verticali (4 micron) con ematossilina eosina (H &amp; E). Eseguire l&#39;analisi immunoistochimica on sezioni 4. </li></ol>

<ol>
	<li>Strell, C., Rundqvist, H., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts-a+key+host+cell+type+in+tumor+initiation,+progression,+and+metastasis.">Fibroblasts-a key host cell type in tumor initiation, progression, and metastasis.</a> Ups. J. Med. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forkhead+box+F1+regulates+tumor-promoting+properties+of+cancer-associated+fibroblasts+in+lung+cancer.">Forkhead box F1 regulates tumor-promoting properties of cancer-associated fibroblasts in lung cancer.</a> Cancer Res. 70 (7), 2644-2654 (2010).</li><li>Kalluri, R., Zeisberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+in+cancer.">Fibroblasts in cancer.</a> Nat. Rev. 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The authors declare that they have no competing financial interests.

CAF formano una componente importante della ECM circostante le cellule tumorali e non solo forniscono una impalcatura per il tumore, ma anche partecipare attivamente nello sviluppo del tumore 7. Accumulando prove dipana l&#39;impatto dei CAF o loro molecole correlate alla eventuale previsione, mettendo in evidenza il ruolo critico della progressione tumorale CAF-mediata 8. Nello studio precedente, abbiamo utilizzato il metodo conseguenza di isolare CAF polmonari 4....

Cancer tissue can be perceived as a type of organ, which evolves through close interactions between the cancer and the tumor stromal microenvironment, composed of cancer-associated fibroblasts (CAFs), immune cells, tumor vessels and the extracellular matrix (ECM). CAFs are the major source of soluble factors (cytokines, growth factors and chemokines) that exert mitogenic, pro-migratory and pro-invasive effects on cancer cells. They also stimulate tumor vessel formation and recruit precursor cells, such as bone marrow-derived cells (BMDC). Activated CAFs are involved in the production and remodeling of the ECM, thereby promoting the growth and spread of cancer cells1. CAFs also provide a niche that facilitates tumor cell colonization and metastasis and are capable of conferring stem cell phenotypes onto neighboring cancer cells. Pathological observations suggest that stromal reactions or fibrotic changes in cancer tissues are indicative of a poor prognosis. Recent studies have also demonstrated that tumor stromal features, such as the gene signature, can predict patient prognosis. Furthermore, CAF-derived factors can modulate sensitivity to chemotherapy, highlighting the role of CAFs in determining drug sensitivity and resistance2.
As CAFs play a multifaceted role in the promotion of tumor progression through signaling pathways that mediate interactions between CAFs and different cell types within the tumor microenvironment, they have attracted increasing attention as novel targets for cancer therapies. The heterogeneity of the cell populations within the cancer microenvironment presents an obstacle for targeting CAFs. Several markers for CAFs have been proposed, such as &#945;-smooth muscle actin (&#945;-SMA), fibroblast activation protein (FAP), and fibroblast specific proten-1 (FSP-1: also called S100A4); however, these molecular markers are not specific for distinguishing CAFs from other cells present in non-cancerous tissues3. Therefore, further studies are needed to obtain more knowledge about the specific properties of CAFs. To this end, it is informative to characterize primary cultured CAFs compared with patient-matched normal fibroblasts.
Recently, analyses on patient-derived CAFs have been reported in several cancer types, revealing unique gene expression patterns and cell behaviors compared with fibroblasts derived from non-cancerous tissues. Using isolated CAFs from human lung cancer tissues, we developed a three-dimensional co-culture method, enabling us to evaluate the properties of lung CAFs. In this model, we investigated the effects of the CAFs on lung cancer cell invasion, proliferation and collagen gel contraction, which experimentally recapitulated the tumor-promoting roles of lung CAFs4.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1035">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:267px;">Name</td>
			<td style="width:297px;">Company</td>
			<td style="width:471px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">DMEM</td>
			<td style="width:297px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:471px;">D5796</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">FBS</td>
			<td style="width:297px;">GIBCO</td>
			<td style="width:471px;">10437</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Collagen type IA</td>
			<td style="width:297px;">Nitta gelatin Inc.</td>
			<td style="width:471px;">CELL-1A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Reconstitution buffer</td>
			<td style="width:297px;">Nitta gelatin Inc.</td>
			<td style="width:471px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Cover slip</td>
			<td style="width:297px;">NUNC</td>
			<td style="width:471px;">174934</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Silicone grease</td>
			<td style="width:297px;">Dow Corning Toray</td>
			<td style="width:471px;">High vacuum grease</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Dispase I</td>
			<td style="width:297px;">WAKO</td>
			<td style="width:471px;">386-02271</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">6-well plate</td>
			<td style="width:297px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:471px;">353046</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Cell strainer (70 &#956;m)</td>
			<td style="width:297px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:471px;">352350</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional co-culture model for tumor-stromal interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal cells. The tumor microenvironment is comprised of a variety of cell types, such as fibroblasts, immune cells, vascular endothelial cells, pericytes and bone-marrow-derived cells, embedded in the extracellular matrix (ECM). Cancer-associated fibroblasts (CAFs) have a pro-tumorigenic role through the secretion of soluble factors, angiogenesis and ECM remodeling. The experimental models for cancer cell survival, proliferation, migration, and invasion have mostly relied on two-dimensional monocellular and monolayer tissue cultures or Boyden chamber assays. However, these experiments do not precisely reflect the physiological or pathological conditions in a diseased organ. To gain a better understanding of tumor stromal or tumor matrix interactions, multicellular and three-dimensional cultures provide more powerful tools for investigating intercellular communication and ECM-dependent modulation of cancer cell behavior. As a platform for this type of study, we present an experimental model in which cancer cells are cultured on collagen gels embedded with primary cultures of CAFs.

Questo metodo di co-coltura, imitando il microambiente tumorale, è uno strumento utile per studiare le interazioni tra cellule tumorali e fibroblasti incorporati in gel di collagene. Nello studio precedente, tre parametri sono stati valutati in questo modello sperimentale: collagene contrazione gel, l&#39;invasione delle cellule tumorali e cambiamento morfologico. La proliferazione delle cellule del cancro è stato stimato utilizzando anche Ki67 immunostaining 4. Campioni di tessuto polmonare sono stati racc...

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Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Here we present a protocol to co-culture in three-dimensions, which is useful for investigating multicellular interactions and extracellular matrix-dependent modulation of cancer cell behavior. In this experimental model, cancer cells are cultured on collagen gels embedded with human cancer-associated fibroblasts.

Tridimensionale Co-cultura Modello di tumore stromale-Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

three-dimensional-co-culture-model-for-tumor-stromal-interaction

Research

JoVE Journal

Medicine

17.2K Views.  The University of Tokyo. Here we present a protocol to co-culture in three-dimensions, which is useful for investigating multicellular interactions and extracellular matrix-dependent modulation of cancer cell behavior. In this experimental model, cancer cells are cultured on collagen gels embedded with human cancer-associated fibroblasts.