Questo lavoro è stato supportato da National Institutes of Health Grants (da R01NS085215 a K.F., T32 GM107000 e F30MH122146 ad A.C.). Gli autori ringraziano la signora Naoe Watanabe per l'abile assistenza tecnica.

Tutti i protocolli sugli animali sono stati esaminati e approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso la University of Massachusetts Medical School. La preparazione della coltura delle fette, la preparazione del plasmide e l'elettroporazione sono anche dettagliate nei nostri metodi precedentemente pubblicati e possono essere indirizzate per ulterioriinformazioni 10.
1. Preparazione della coltura delle fette
<ol><li>Preparare le colture di fette ippocampali organotipiche del topocome descritto in precedenza 11, usando topi postnatali di 6-7 giorni di entrambi i sessi.<ol>
<li>Preparare i mezzi di dissezione per la coltura di fette organotipiche costituite da (in mM): 238 saccarosio, 2,5 KCl, 1 CaCl2,4MgCl 2 , 26 NaHCO3,1 NaH2PO4e 11 glucosio in acqua deionizzata, quindi gas con 5% CO2/95% O2 a un pH di 7,4.</li>
		<li>Preparare supporti di coltura a fette organotipiche costituiti da: 78,8% (v/v) Minimum Essential Medium Eagle, Siero di cavallo 20% (v/v), 17,9 mM NaHCO3, 26,6 mM di glucosio, 2 M CaCl2, 2 M MgSO4, 30 mM HEPES, insulina (1 μg/mL) e 0,06 mM di acido ascorbico, pH regolato a 7,3. Regolare l'osmolarità a 310-330 osmol usando un osmometro.</li>
		<li>Seziona gli ippocampi da tutto il cervello usando due spatole e affetta (400 μm) usando un elicottero tissutale. Separare le fette utilizzando due forcep e trasferire a inserti di coltura cellulare da 30 mm in una piastra di 6 po 'riempita con mezzi di coltura (950 μL) sotto gli inserti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Conservare le colture di fette organotipiche in un incubatore di colture tissutali (35°C, 5% CO2)e cambiare il supporto di coltura delle fette ogni due giorni.</li>
</ol>2. Preparazione plasmide
<ol><li>Preparare il plasmide per il gene di interesse.<ol>
<li>Gene di proteina fluorescente verde potenziata subclone (EGFP) in un vettore pCAG.</li>
		<li>Purificare il plasmide pCAG-EGFP con un kit di purificazione privo di endotossine e dissolversi in una soluzione interna costituita da acqua trattata con pirocarbonato dietile contenente 140 mM K-metanosolfonato, 0,2 mM EGTA, 2 mM MgCl2e 10 mM HEPES, regolati in pH 7.3 con KOH (concentrazione di plasmidi: 0,1 μg/μL).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Preparazione pipetta di vetro
<ol><li>Tirare pipette di vetro borosilicato (4,5 - 8 MΩ) su un estrattore di micropipette (Figura 1A). NOTA: Le pipette in vetro utilizzate per le registrazioni di morsetti patch a celle intere sono ideali per l'elettroporazione.</li>
	<li>Cuocere pipette di vetro durante la notte a 200 °C per sterilizzare.</li>
	<li>Controllare le dimensioni della punta della pipetta sotto un microscopio a dissezione per approssimare la resistenza elettrica.<ol>
<li>Facoltativo:Verificare la resistenza delle pipette collegando la pipetta all'elettrodo di elettroporazione e utilizzare il micromanipolatore per manovrare la punta della pipetta in liquido cerebrospinale artificiale sterilizzato a filtro (aCSF) contenente (in mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl2, 5 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4 e 11 glucosio in acqua deionizzata, gassato con il 5% di CO2/95% O2 a un pH di 7,4. Confermare la resistenza effettiva utilizzando la lettura sull'elettroporatore. NOTA: Più nitida è la punta della pipetta, maggiore è la resistenza elettrica. La resistenza della pipetta dovrebbe essere inferiore a 10 MΩ. Pipette di vetro ad alta resistenza alla pipetta(Figura 1B)spesso si ostruiscono sulla punta durante l'elettroporazione ripetuta.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Configurazione del carro di elettroporazione
<ol><li>Installare l'elettroporatore su un impianto di elettrofisiologia standard a celle intere, dotato di un microscopio verticale montato su un tavolo di cambiata con micromanipolatore e pompa peristaltica.</li>
	<li>Installare il headstage dell'elettroporatore su un micromanipolatore e collegare un paio di altoparlanti all'elettroporatore. Collegare l'elettroporatore a un pedale che può essere utilizzato per inviare un impulso quando è pronto. NOTA: Gli altoparlanti emettono un tono quando sono accesi, che è un indicatore della resistenza elettrica all'elettrodo. Ciò consente di determinare i relativi cambiamenti nella resistenza senza allontanare l'attenzione dalla procedura.</li>
</ol>5. Preparazione dell'elettroporazione
<ol><li>Trasferire inserti di coltura a fette da 6 piastre di pozzo a 3 cm piastre di Petri caricate con 900 μL di mezzi di coltura e conservare in un incubatore di CO2 da tavolo fino a quando non sono pronti per eseguire l'elettroporazione.<ol>
<li>Preincubare inserti di coltura fresca con mezzi di coltura a fette (1 mL) per almeno 30 minuti in una piastra di Petri da 3,5 cm a fette di coltura dopo l'elettroporazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pulire e preparare il carro per l'elettroporazione.<ol>
<li>Perfondere le linee con candeggina al 10% per 5 minuti per sterilizzare i tubi e la camera prima di iniziare l'esperimento per la giornata.</li>
		<li>Perfondere le linee con acqua autoclavata deionizzata per almeno 30 minuti per risciacquare completamente.</li>
		<li>Perfondere le linee con aCSF sterilizzato con filtro contenente tetrodotossine da 0,001 mM (TTX). NOTA: TTX riduce al minimo la tossicità cellulare e la morte dovuta all'eccitazione troppo troppo degli internanti10.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Impostare i parametri dell'impulso dell'elettroporatore: ampiezza di -5 V, impulso quadrato, treno di 500 ms, frequenza di 50 Hz e una larghezza dell'impulso di 500 μs.</li>
	<li>Riempire pipetta di vetro con 5 μL di soluzione interna contenente plasmidi.<ol>
<li>Rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate dalla punta della pipetta svolazzando e toccando delicatamente la punta più volte.</li>
		<li>Controllare la punta per eventuali danni visualizzandola al microscopio a dissezione o ripetendo il passaggio 3.3.1 per verificare la resistenza delle pipette. NOTA: Se la punta è danneggiata, la pipetta di vetro deve essere scartata e questo passaggio deve essere ripetuto con una nuova pipetta di vetro precedentemente preparata al passaggio 3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fissare saldamente la punta della pipetta all'elettrodo e accendere gli altoparlanti. Registrare la lettura (resistenza della pipetta) dell'elettroporatore quando la punta ha preso contatto con il mezzo aCSF.</li>
	<li>Tagliare la membrana di inserimento della coltura utilizzando una lama affilata e isolare una coltura di fette. Trasferire con cura la coltura della fetta nella camera di elettroporazione utilizzando forcep angolate affilate e fissarne la posizione con un'ancora a fette.<ol>
<li>Non mantenere la coltura della fetta al di fuori dell'incubatore per più di 30 minuti alla volta per prevenire effetti collaterali come cambiamenti nella salute neuronale onella funzione 12.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Cellule elettroporate di interesse
<ol><li>Applicare una pressione positiva sulla pipetta con la bocca o utilizzando una siringa da 1 ml (pressione 0,2 - 0,5 ml) attaccata al tubo.</li>
	<li>Utilizzare i comandi della manopola tridimensionale del micromanipolatore per manovrare la punta della pipetta vicino alla superficie della coltura della fetta.</li>
	<li>Scegli una cellula bersaglio e avvicinati, mantenendo visibile al microscopio la pressione positiva applicata fino a quando non si forma una fossetta sulla superficie cellulare.</li>
	<li>Eseguire cicli di pressione.<ol>
<li>Applicare rapidamente una leggera pressione negativa per bocca in modo che si formi una guarnizione sciolta tra la punta della pipetta e la membrana plasmatica, indicata visivamente dalla membrana che sale in qualche modo nella punta della pipetta. Osservare un aumento (~2,5 volte la resistenza iniziale) nella resistenza delle pipette ascoltando un aumento del tono proveniente dagli altoparlanti. Riimposi rapidamente la pressione positiva in modo che la fossette si ri-forma.</li>
		<li>Completare immediatamente almeno altri due cicli di pressione senza fermarsi, quindi tenere premuta la pressione negativa per 1 s. NOTA: Fermarsi tra un ciclo e l'altro, applicare troppa pressione o mantenere la pressione negativa per troppo tempo può causare danni significativi alle cellule e possibilmente causare la morte della cellula durante l'elettroporazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pulsare rapidamente l'elettroporatore una volta che si utilizza il pedale quando il tono degli altoparlanti raggiunge un apice stabile nel passo, indicando un picco di resistenza elettrica. Non aspettare al picco di resistenza per più di 1 s prima di inviare l'impulso. NOTA: Non abbiamo osservato alcuna elettroporazione off-target quando si utilizza questo protocollo10. Solo le celle a contatto con la pipetta di vetro durante i cicli di pressione sono state trasfette. Il posizionamento della pipetta vicino ad altri neuroni non si trasfezione genica.</li>
	<li>Ritrarre delicatamente la pipetta a circa 100 μm dalla cella senza applicare pressione.</li>
	<li>Riapplicazionere la pressione positiva, verificando che la resistenza sia simile alla lettura registrata nel passaggio 5.5, quindi avvicinarsi alla cella successiva.<ol>
<li>Rimuovere i potenziali zoccoli, indicati visivamente o da una resistenza alle pipette significativamente aumentata (>15% in più) dopo l'elettroporazione, applicando una pressione positiva. NOTA: Se non c'è intasamento visibile e la resistenza è ancora significativamente più alta, scartare la pipetta e usarne una nuova. In media, una pipetta può essere utilizzata per un massimo di 20 eventi di elettroporazione se l'utente è attento10.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo l'elettroporazione, trasferire la coltura della fetta su un inserto di coltura fresco e incubare a 35 °C nell'incubatore per un massimo di 3 giorni.</li>
</ol>7. Fissazione, colorazione e imaging di colture organotipiche di fette ippocampali
<ol><li>Fissare le colture di fette organotipiche elettroporate 2 - 3 giorni dopo la trasfezione con paraformaldeide al 4% e saccarosio al 4% in soluzione salina tamponata con fosfato 0,01 M (1x PBS) per 1,5 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere le fette fissive e incubare in saccarosio al 30% in tampone fosfato da 0,1 M (1x PB) per 2 ore.</li>
	<li>Posizionare le fette su un vetro scorrevole e congelarle mettendo il vetro scorrevole sopra il ghiaccio secco schiacciato. Scongelare le fette a temperatura ambiente e trasferirle in una piastra da 6 pomp po' riempita con 1x PBS.</li>
	<li>Macchiare le fette con anticorpi anti-GFP e coniglio anti-RFP nel tampone GDB (0,1% gelatina, 0,3% Triton X-100, 450 mM NaCl e 32% 1x PB, pH 7,4) per 2 ore a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare le fette con 1x PBS tre volte a temperatura ambiente per 10 minuti ciascuno di lavaggio.</li>
	<li>Incubare le fette con anticorpo secondario coniugato anti-topo Alexa 488 e anticorpo secondario coniugato anti-coniglio Alexa 594 nel tampone GDB per 1 h a temperatura ambiente. Incubare le fette con DAPI (4 μg/mL) in 1x PBS per 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare le fette con 1x PBS tre volte a temperatura ambiente per 3 minuti ogni lavaggio.</li>
	<li>Montare le fette su vetrini utilizzando il mezzo di montaggio ed eseguire l'imaging a fluorescenza.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Washbourne, P., McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+gene+transfer+into+neurons.">Techniques for gene transfer into neurons.</a> Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 566-573 (2002).</li><li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+by+direct+microinjection+of+DNA+into+cultured+mammalian+cells.">High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells.</a> Cell. 22 (2), 479-488 (1980).</li><li>Rae, J. L., Levis, R. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+rat+CA1+neurones+in+acute+versus+organotypic+slices:+role+of+experience+in+synaptic+morphology+and+activity.">Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity.</a> Journal of Physiology. 550, 135-147 (2003).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Descriviamo qui un metodo di elettroporazione che trasfetta sia i neuroni eccitatori che inibitori con alta efficienza e precisione. Il nostro protocollo di elettroporazione ottimizzato ha tre innovazioni innovative per ottenere una trasfezione genica altamente efficiente. La nostra prima modifica è stata l'aumento delle dimensioni delle pipette rispetto ai protocolliprecedentemente pubblicati 3,5,6. Questo cambiamento ci ha pe...

In biologia molecolare, una delle considerazioni più importanti per uno studio è come fornire un gene di interesse in una cellula o popolazione di cellule per chiarire la sua funzione. I diversi metodi di somministrazione possono essere classificati come biologici (ad esempio, un vettore virale), chimici (ad esempio, fosfato di calcio o lipidi) o fisici (ad esempio, elettroporazione, microiniezione o biolistici)1,2. I metodi biologici sono altamente efficienti e possono essere specifici del tipo cellulare, ma sono limitati dallo sviluppo di specifici strumenti genetici. Gli approcci chimici sono molto potenti in vitro, ma le trasfettenze sono generalmente casuali; inoltre, questi approcci sono per lo più riservati solo alle cellule primarie. Tra gli approcci fisici, la biolistica è la più semplice e semplice da un punto di vista tecnico, ma ancora una volta produce risultati di trasfezione casuali con un'efficienza relativamente bassa. Per applicazioni che richiedono il trasferimento in cellule specifiche senza la necessità di sviluppare strumenti genetici, guardiamo all'elettroporazione asingola cella 3,4.
Mentre l'elettroporazione si riferiva solo all'elettroporazione sul campo, negli ultimi vent'anni sono stati sviluppati protocolli multipli di elettroporazione a singola cella in vitro e in vivo per migliorare laspecificità e l'efficienza 5,6,7, dimostrando che l'elettroporazione può essere utilizzata per trasferire geni a singole cellule e può quindi essere estremamente precisa. Tuttavia, le procedure sono tecnicamente impegnative, dispendiose in termini di tempo e relativamente inefficienti. In effetti, documenti più recenti hanno studiato la fattibilità dei carri meccanizzati di elettroporazione8,9, che possono aiutare ad eliminare molte di queste barriere per gli investigatori interessati all'installazione di tale robotica. Ma per coloro che cercano mezzi più semplici, i problemi con l'elettroporazione, vale a dire la morte cellulare, il fallimento della trasfezione e l'intasamento delle pipette, rimangono una preoccupazione.
Recentemente abbiamo sviluppato un metodo di elettroporazione che utilizza pipette di vetro con punta più grande, parametri di impulsi elettrici più lievi e un passaggio di ciclo della pressione unico, che ha generato un'efficienza di trasfezione molto più elevata nei neuroni eccitatori rispetto ai metodi precedenti, e ci ha permesso per la prima volta di trasfetto geni in internauri inibitori, tra cui internauri inibitori che esprimono somatostatina nella regione ippocampale CA1 della coltura organotipica del topo10. Tuttavia, l'affidabilità di questo metodo di elettroporazione in diversi tipi di internauron inibitori e stadi di sviluppo neuronale non è stata affrontata. Qui, abbiamo dimostrato che questa tecnica di elettroporazione è in grado di trasfetto i geni sia nei neuroni eccitatori che in diverse classi di internauri. È importante sottolineare che l'efficienza della trasfezione era elevata indipendentemente dai giorni in vitro (DIV) di coltura delle fette testate. Questa tecnica consolidata e di facile utilizzo è altamente raccomandata a qualsiasi ricercatore interessato a utilizzare l'elettroporazione a singola cellula per diversi tipi di cellule nel contesto del tessuto cerebrale del topo in vitro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Plasmid preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organotypic slice culture preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Plates</td>
			<td>GREINER BIO-ONE</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>#5/45</td>
			<td>Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCHVU02RE</td>
			<td>Filtration and storage of culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>BD C150-UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td>TED PELLA, INC.</td>
			<td>10180</td>
			<td>Tissue chopper for organotypic slice culture preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert, 30 mm</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PIHP03050</td>
			<td>Organotypic slice culture inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>Precision Systems</td>
			<td>OSMETTE II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE coated spatulas</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>SK-06369-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14958-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Vacuum Filtration System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPT01RE</td>
			<td>Filtration and storage of aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glasses</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipetter Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>Puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Binder</td>
			<td>BD (E2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puller Filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>FB330B</td>
			<td>Puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 mm Falcon Petri Dishes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airtable</td>
			<td>TMC</td>
			<td>63-7512E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Q Imaging</td>
			<td>Retiga-2000DC</td>
			<td>Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation System</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axoporator 800A</td>
			<td>Electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Illumination System</td>
			<td>Prior</td>
			<td>Lumen 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulator</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MPC-385</td>
			<td>Manipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metamorph software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>Dynamax, RP-2</td>
			<td>Perfusion pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shifting Table</td>
			<td>Luigs &#38; Neuman</td>
			<td>240 XY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speaker</td>
			<td>Unknown</td>
			<td></td>
			<td>Speakers connected to the electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table Top Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MIDI 40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX61WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence imaging #2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-One Fluorescence Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X710</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell electroporation across different organotypic slice culture of mouse hippocampal excitatory and class-specific inhibitory neurons

L'elettroporazione si è affermata come un metodo critico per trasferire geni specifici nelle cellule per comprenderne la funzione. Qui descriviamo una tecnica di elettroporazione a una cellula che massimizza l'efficienza (~80%) della trasfezione genica in vitro nei neuroni inibitori eccitatori e specifici della classe nella coltura di fette ippocampali organotipiche del topo. Utilizzando grandi elettrodi di vetro, liquido cerebrospinale artificiale contenente tetrodotossine e impulsi elettrici lievi, abbiamo fornito un gene di interesse in neuroni piramidali CA1 ippocampali coltivati e internauri inibitori. Inoltre, l'elettroporazione potrebbe essere effettuata in fette ippocampali coltivate fino a 21 giorni in vitro senza alcuna riduzione dell'efficienza di trasfezione, consentendo lo studio di varie fasi di sviluppo della coltura delle fette. Con l'interesse crescente nell'esaminare le funzioni molecolari dei geni in una vasta gamma di tipi di cellule, il nostro metodo dimostra un approccio affidabile e diretto alla trasfezione genica in vitro nel tessuto cerebrale del topo che può essere eseguita con le apparecchiature e le tecniche di elettrofisiologia esistenti.

La nostra elettroporazione a una cellula è in grado di fornire con precisione geni in neuroni eccitatori e inibitori visivamente identificati. Abbiamo elettroporato tre diversi tipi di cellule neuronali in tre diversi punti di tempo. Parvalbumin (Pv) o glutammato vescicolare di tipo 3 (VGT3) che esprimono neuroni sono stati visualizzati incrociando linee Pvcre (JAX #008069) o VGT3cre (JAX #018147) con linee TdTomato (una variante di proteina fluorescente rossa) (Jax #007905), rispettivamente chiama...

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Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

Presentato qui è un protocollo per l'elettroporazione a singola cellula in grado di fornire geni sia nei neuroni eccitatori che inibitori in una vasta gamma di età della coltura di fette ippocampali in vitro. Il nostro approccio fornisce un'espressione precisa ed efficiente dei geni nelle singole cellule, che può essere utilizzata per esaminare le funzioni cellulari autonome e intercellulari.

Elettroporazione a cella singola attraverso diverse culture di fette organotipiche di neuroni eccitatori ippocampali del topo e specifici della classe

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a ...

single-cell-electroporation-across-different-organotypic-slice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.6K Views.  University of Massachusetts Medical School. Presentato qui è un protocollo per l'elettroporazione a singola cellula in grado di fornire geni sia nei neuroni eccitatori che inibitori in una vasta gamma di età della coltura di fette ippocampali in vitro. Il nostro approccio fornisce un'espressione precisa ed efficiente dei geni nelle singole cellule, che può essere utilizzata per esaminare le funzioni cellulari autonome e intercellulari.

Video: Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

Il organotipica ippocampale Cultura Modello Slice per l&#39;esame di danno neuronale

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Ricerca

Neuroscienze

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in which the enhanced version of the green fluorescent protein (EGFP) is exclusively expressed in all neurons of the developing central and peripheral nervous system1, allowing the possibility to both film the innervation of the forelimb and to manipulate this process with pharmacological and genetic techniques2. The most critical parameter in the successful cultivation of such slice cultures is the method by which the slices are prepared. After extensive testing of a variety of methods, we have found that a vibratome is the best possible device to slice the embryos such that they routinely result in a culture that demonstrates viability over a period of several days, and most importantly, develops in an age-specific manner. For mid-gestation embryos, this includes the normal outgrowth of spinal nerves from the spinal cord and the dorsal root ganglia to their targets in the periphery and the proper determination of skeletal and muscle tissue. 
In this work, we present a method for processing whole embryos of embryonic day (E) E10 to E12 into 300 - 400 micrometer slices for cultivation in a standard tissue culture incubator, which can be studied for up to two days after slice preparation. Critical for the success of this approach is the use of a vibratome to slice each agarose-embedded embryo. This is followed by the cultivation of the slices upon Millicell culture membrane inserts placed upon a small volume of medium, resulting in an interface culture technique. One litter with an average of 7 embryos routinely produces at least 14 slices (2-3 slices of the forelimb region per embryo), which varies slightly due to the age of the embryos as well as to the thickness of the slices. About 80% of the cultured slices show nerve outgrowth, which can be measured througout the culturing period2. Representative results using the tauGFP mouse line are demonstrated.

We present a method to prepare organotypic slices of mid-gestation mouse embryos for the cultivation and time-lapse imaging of peripheral nerve outgrowth.

Slice Cultura organotipica di GFP che esprimono embrioni di topo per imaging in tempo reale della crescita degli nervi periferici

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection e cultura primaria di neuroni embrionali di topo ippocampale e corticale

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotipica Culture Slice ippocampale

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Isolamento e la coltura di neuroni ippocampali da topi prenatali

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and gene expression programs for extremely rare cell subsets has been a challenge using standard whole-tissue approaches. Gene expression profiling of individual cells allows for unprecedented access to cell types that comprise only a small percentage of the total tissue1-7. In addition, this technique can be used to examine the gene expression programs that are transiently expressed in small numbers of cells during dynamic developmental transitions8.
This issue of cellular diversity arises repeatedly in the central nervous system (CNS) where neuronal connections can occur between quite diverse cells9. The exact number of distinct cell types is not precisely known, but it has been estimated that there may be as many as 1000 different types in the cortex itself10. The function(s) of complex neural circuits may rely on some of the rare neuronal types and the genes they express. By identifying new markers and helping to molecularly classify different neurons, the single-cell approach is particularly useful in the analysis of cell types in the nervous system. It may also help to elucidate mechanisms of neural development by identifying differentially expressed genes and gene pathways during early stages of neuronal progenitor development.
As a simple, easily accessed tissue with considerable neuronal diversity, the vertebrate retina is an excellent model system for studying the processes of cellular development, neuronal differentiation and neuronal diversification. However, as in other parts of the CNS, this cellular diversity can present a problem for determining the genetic pathways that drive retinal progenitors to adopt a specific cell fate, especially given that rod photoreceptors make up the majority of the total retinal cell population11. Here we report a method for the identification of the transcripts expressed in single retinal cells (Figure 1). The single-cell profiling technique allows for the assessment of the amount of heterogeneity present within different cellular populations of the retina2,4,5,12. In addition, this method has revealed a host of new candidate genes that may play role(s) in the cell fate decision-making processes that occur in subsets of retinal progenitor cells8. With some simple adjustments to the protocol, this technique can be utilized for many different tissues and cell types.

A method for the isolation of single retinal cells and subsequent amplification of their cDNAs is described. Single-cell transcriptomics reveals the degree of cellular heterogeneity present in a tissue and uncovers new marker genes for rare cell populations. The accompanying protocol can be adjusted to suit many different cell types.

Single-cell Profiling dei neuroni retinici maturi e in sviluppo

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Cultura primario di topo neuroni dopaminergici

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Culture Organotipica Slice per studiare Oligodendrocyte Dynamics e mielinizzazione

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Associati a cellule intere registrazioni in organotipiche fettine di ippocampo

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

L&#39;analisi di neurovascolare ritocca in Entorhino-ippocampali Culture Organotipica Slice

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...