Bu çalışma Ulusal Sağlık Hibe Enstitüleri (R01NS085215 ila K.F., T32 GM107000 ve F30MH122146 ila A.C. ) tarafından desteklendi. Yazarlar, Bayan Naoe Watanabe'ye yetenekli teknik yardım için teşekkür ediyorlar.

Tüm hayvan protokolleri Massachusetts Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından incelendi ve onaylandı. Dilim kültürü hazırlama, plazmid hazırlama ve elektroporasyon da daha önce yayınlanan yöntemlerimizde ayrıntılı olarak açıklanmıştır ve ek bilgi için başvurulabilir10.
1. Dilim kültürü hazırlığı
<ol><li>Daha önce açıklandığı gibi fare organotipik hipokampal dilim kültürleri hazırlayın11, her iki cinsiyetin doğum sonrası 6 ila 7 günlük farelerini kullanarak.<ol>
<li>Diseksiyon ortamını (mM olarak): 238 sakkarozdan oluşan organotipik dilim kültürü için hazırlayın, 2.5 KCl, 1 CaCl2, 4 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4ve deiyonize suda 11 glikoz, daha sonra% 5 CO2/ 95% O2 ile 7.4 pH'a gaz.</li>
		<li>Organotipik dilim kültür medyasını hazırlayın: %78,8 (v/v) Minimum Esansiyel Orta Kartal, %20 (v/v) at serumu, 17,9 mM NaHCO3, 26,6 mM glikoz, 2 M CaCl2, 2 M MgSO4, 30 mM HEPES, insülin (1 μg/mL) ve 0,06 mM askorbik asit, pH 7,3'e ayarlanmıştır. Omometre kullanarak omuzolariteyi 310-330 osmol'e ayarlayın.</li>
		<li>Hipokampiyi iki spatula kullanarak tüm beyinden ayırın ve bir doku helikopteri kullanarak dilimleyin (400 μm). İki ton sesi kullanarak dilimleri ayırın ve kesici uçların altındaki kültür ortamı (950 μL) ile dolu 6 kuyu plakasında 30 mm hücre kültürü kesici uçlarına aktarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Organotipik dilim kültürlerini bir doku kültürü inkübatöründe (%35°C, %5 CO2)saklayın ve dilim kültürü ortamını iki günde bir değiştirin.</li>
</ol>2. Plazmid hazırlığı
<ol><li>Plazmidi ilgi genine hazırlayın.<ol>
<li>Bir pCAG vektörüne yeşil floresan protein (EGFP) geninin alt sıvısı.</li>
		<li>pCAG-EGFP plazmidini endotoksin içermeyen bir arıtma kiti ile arındırın ve 140 mM K-metansülfonat içeren dietil pirokarbonat arıtılmış sudan oluşan bir iç çözeltide çözün, 0,2 mM EGTA, 2 mM MgCl2ve 10 mM HEPES, KOH ile pH 7,3'e ayarlanmıştır (plazmid konsantrasyonu: 0,1 μg/μL).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Cam pipet hazırlama
<ol><li>Bir mikropipette çekme üzerine borosilikat cam pipetleri (4,5 – 8 MΩ) çekin (Şekil 1A). NOT: Tüm hücreli yama kelepçe kayıtları için kullanılan cam pipetler elektroporasyon için idealdir.</li>
	<li>Sterilize etmek için cam pipetleri 200°C'de geceleyin pişirin.</li>
	<li>Elektrik direncini yaklaşık olarak görmek için pipet ucunun boyutunu diseksiyon mikroskobu altında kontrol edin.<ol>
<li>İsteğe bağlı:Pipeti elektroporasyon elektroduna bağlayarak pipet direncini doğrulayın ve pipet ucunu filtre sterilize edilmiş yapay beyin omurilik sıvısına (aCSF) manevra yapmak için mikromanipülatörü kullanın (mM): 119 NaCl, 2.5 KCl, 0.5 CaCl2, 5 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4 ve 11 glikoz deiyonize suda, % 5 CO2 /95O2 ile 7.4 pH'a gazlanır. Elektroporatördeki okumayı kullanarak gerçek direnci onaylayın. NOT: Pipet ucu ne kadar keskinse, elektrik direnci o kadar büyük olacaktır. Pipet direnci 10 MΩ'nin altında olmalıdır. Yüksek pipet direncine sahip cam pipetler (Şekil 1B) genellikle tekrarlanan elektroporasyon sırasında ucu tıkanır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Elektroporasyon teçhizatı kurulumu
<ol><li>Elektroporatörü, bir mikromanipülatör ve peristaltik pompa ile değişen bir masaya monte edilmiş dik bir mikroskopla donatılmış standart bir tam hücre elektrofizyoloji makinesine takın.</li>
	<li>Elektroporatörün başlığını bir mikromanipülatöre takın ve bir çift hoparlörü elektroporatöre bağlayın. Elektroporatörü, hazır olduğunda nabız göndermek için kullanılabilecek bir ayak pedalı ile bağlayın. NOT: Hoparlörler açıldığında bir ton yayar, bu da elektrot üzerindeki elektrik direncinin bir göstergesidir. Bu, dikkatleri prosedürden uzaklaştırmadan dirençteki göreceli değişiklikleri belirlemeyi mümkün kılar.</li>
</ol>5. Elektroporasyon hazırlığı
<ol><li>Dilim kültürü kesici uçlarını 6 kuyu tabağından 900 μL kültür ortamı ile yüklenmiş 3 cm Petri tabaklarına aktarın ve elektroporasyon yapmaya hazır olana kadar bir masa üstü CO2 inkübatörde saklayın.<ol>
<li>Taze kültür eklemelerini, elektrik çarpmasından sonra kültür dilimlerine 3,5 cm Petri kabında en az 30 dakika boyunca dilim kültür ortamı (1 mL) ile ön kuluçkaya yatırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Makineyi temizleyin ve elektroporasyona hazırlayın.<ol>
<li>Gün için deneye başlamadan önce boruyu ve hazneyi sterilize etmek için hatları 5 dakika boyunca% 10 çamaşır suyu ile perfuse edin.</li>
		<li>Tamamen durulamak için hatları deiyonize otoklavlı suyla en az 30 dakika boyunca perfuse edin.</li>
		<li>Hatları 0.001 mM tetrodotoxin (TTX) içeren filtre sterilize edilmiş aCSF ile destekleyin. NOT: TTX, internöronların aşırı heyecanlanması nedeniyle hücresel toksisiteyi ve ölümü en aza indirir10.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Elektroporatörun darbe parametrelerini ayarlayın: –5 V genliği, kare darbe, 500 ms tren, 50 Hz frekans ve 500 μs darbe genişliği.</li>
	<li>Cam pipeti 5 μL plazmid içeren iç çözelti ile doldurun.<ol>
<li>Kıstırılan hava kabarcıklarını pipet ucundan hafifçe dokunarak ve ucuna birden fazla kez dokunarak çıkarın.</li>
		<li>Ucu diseksiyon mikroskobu altında görselleştirerek veya pipet direncini kontrol etmek için 3.3.1 adımını tekrarlayarak hasara karşı kontrol edin. NOT: Uç hasarlıysa, cam pipet atılmalıdır ve bu adım daha önce 3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pipet ucunu elektrota güvenli bir şekilde takın ve hoparlörleri açın. Uç aCSF ortamıyla temas ettiğinde elektroporatörnün okumasını (pipet direnci) kaydedin.</li>
	<li>Keskin bir bıçak kullanarak kültürün ekleme zarını kesin ve bir dilim kültürünü izole edin. Keskin açılı empepiler kullanarak dilim kültürünü elektroporasyon odasına dikkatlice aktarın ve konumunu bir dilim ankrajı ile sabitleyin.<ol>
<li>Dilim kültürünü, nöronal sağlıktaki değişiklikler veya işlev12gibi yan etkileri önlemek için bir seferde 30 dakikadan fazla inkübatörün dışında tutmayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. İlgi çekici elektroporat hücreleri
<ol><li>Pipete ağızla veya boruya bağlı 1 mL şırıngar (0,2 - 0,5 mL basınç) kullanarak pozitif basınç uygulayın.</li>
	<li>Pipet ucunu dilim kültürünün yüzeyine yakın bir yerde manevra yapmak için mikromanipülatör 3 boyutlu düğme kontrollerini kullanın.</li>
	<li>Bir hedef hücre seçin ve mikroskopta görünür olan hücre yüzeyinde bir gamze oluşana kadar uygulanan pozitif basıncı koruyarak ona yaklaşın.</li>
	<li>Basınç döngüleri gerçekleştirin.<ol>
<li>Boru ucu ile plazma zarı arasında gevşek bir sızdırmazlık oluşur, böylece membran pipet ucuna biraz yukarı çıkar. Hoparlörlerden gelen tonda bir artış dinleyerek pipet direncinde bir artış (~2,5 kat başlangıç direnci) gözlemleyin. Gamzenin yeniden şekillenebilmesi için pozitif basıncı hızlı bir şekilde yeniden uygulayın.</li>
		<li>Duraklatmadan en az iki basınç döngüsünü daha hemen tamamlayın, ardından 1 sn boyunca negatif basınç tutun. NOT: Döngüler arasında duraklamak, çok fazla basınç uygulamak veya negatif basıncı çok uzun süre tutmak önemli hücre hasarına neden olabilir ve muhtemelen elektroporasyon sırasında hücrenin ölmesine neden olabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hoparlörlerden gelen ton perdede sabit bir tepe noktasına ulaştığında ayak pedalını kullanarak elektroporatöre hızlı bir şekilde darbe yapın ve bu da en yüksek elektrik direncini gösterir. Nabzı göndermeden önce 1 s'den fazla tepe direncinde beklemeyin. NOT: Bu protokolü kullanırken hedef dışı elektroporasyon gözlemlemedik10. Sadece basınç döngüleri sırasında cam pipetle temas eden hücreler transkröme edildi. Pipetin diğer nöronların yakınında konumlandırılması gen transfeksiyonla sonuç vermez.</li>
	<li>Pipeti basınç uygulamadan hücreden yaklaşık 100 μm geri çek.</li>
	<li>Direncin 5.5.<ol>
<li>Elektroporasyondan sonra görsel olarak veya önemli ölçüde artmış (%>15 daha yüksek) pipet direnci ile belirtilen potansiyel tıkanıklıkları pozitif basınç uygulayarak çıkarın. NOT: Görünür bir tıkanıklık yoksa ve direnç hala önemli ölçüde daha yüksekse, pipeti atın ve yeni bir tane kullanın. Ortalama olarak, kullanıcı dikkatli olursa 20 elektroporasyon olayı için bir pipet kullanılabilir10.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Elektroporasyondan sonra, dilim kültürünü taze bir kültür kesici ucuna aktarın ve 3 güne kadar inkübatörde 35 ° C'de kuluçkaya yatırın.</li>
</ol>7. Organotipik hipokampal dilim kültürlerinin sabitlenmesi, lekelenmesi ve görüntülenmesi
<ol><li>Elektroporlu organotipik dilim kültürlerini transeksiyondan 2 – 3 gün sonra% 4 paraformaldehit ve% 4 sakkaroz ile 0.01 M fosfat tamponlu salin (1x PBS) oda sıcaklığında 1.5 saat sabitleyin.</li>
	<li>2 saat boyunca 0,1 M fosfat tamponunda (1x PB) %30 sakkarozda sabitleyici ve kuluçka dilimlerini çıkarın.</li>
	<li>Dilimleri bir slayt camına yerleştirin ve slayt camını ezilmiş kuru buzun üzerine koyarak dondurun. Dilimleri oda sıcaklığında çözün ve 1x PBS ile dolu 6 kuyu plakasına aktarın.</li>
	<li>Dilimleri GDB tamponunda fare anti-GFP ve tavşan anti-RFP antikorları (%0,1 jelatin, %0,3 Triton X-100, 450 mM NaCl ve %32 1x PB, pH 7,4) ile oda sıcaklığında 2 saat boyunca lekeleyin.</li>
	<li>Her yıkama için oda sıcaklığında üç kez 1x PBS ile dilimleri yıkayın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 1 saat boyunca GDB tamponunda anti-fare Alexa 488 konjuge ikincil antikor ve anti-tavşan Alexa 594 konjuge ikincil antikor ile dilimleri kuluçkaya yatırın. Dapi (4 μg/mL) ile dilimleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1x PBS'de kuluçkaya yatır.</li>
	<li>1x PBS'li dilimleri oda sıcaklığında üç kez yıkayın ve her yıkamada 3 dakika yıkayın.</li>
	<li>Montaj ortamını kullanarak dilimleri cam slaytlara monte edin ve floresan görüntüleme gerçekleştirin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Washbourne, P., McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+gene+transfer+into+neurons.">Techniques for gene transfer into neurons.</a> Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 566-573 (2002).</li><li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+by+direct+microinjection+of+DNA+into+cultured+mammalian+cells.">High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells.</a> Cell. 22 (2), 479-488 (1980).</li><li>Rae, J. L., Levis, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+electroporation.">Single-cell electroporation.</a> Pflugers Archives: European Journal of Physiology. 443 (4), 664-670 (2002).</li><li>Teruel, M. N., Blanpied, T. A., Shen, K., Augustine, G. J., Meyer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+microporation+technique+for+the+transfection+of+cultured+CNS+neurons.">A versatile microporation technique for the transfection of cultured CNS neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 93 (1), 37-48 (1999).</li><li>Rathenberg, J., Nevian, T., Witzemann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transfection+of+individual+neurons+using+modified+electrophysiology+techniques.">High-efficiency transfection of individual neurons using modified electrophysiology techniques.</a> Journal of Neuroscience Methods. 126 (1), 91-98 (2003).</li><li>Tanaka, M., Yanagawa, Y., Hirashima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+small+interfering+RNA+by+single-cell+electroporation+in+cerebellar+cell+cultures.">Transfer of small interfering RNA by single-cell electroporation in cerebellar cell cultures.</a> Journal of Neuroscience Methods. 178 (1), 80-86 (2009).</li><li>Wiegert, J. S., Gee, C. E., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Electroporation+of+Neurons.">Single-Cell Electroporation of Neurons.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (2), 094904 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robot+for+high+yield+electrophysiology+and+morphology+of+single+neurons+in+vivo.">A robot for high yield electrophysiology and morphology of single neurons in vivo.</a> Nature Communication. 8, 15604 (2017).</li><li>Steinmeyer, J. D., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+manipulation+in+brain+tissue.">High-throughput single-cell manipulation in brain tissue.</a> PLoS One. 7 (4), 35603 (2012).</li><li>Keener, D. G., Cheung, A., Futai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+method+for+single-cell+electroporation+in+mouse+organotypic+hippocampal+slice+culture.">A highly efficient method for single-cell electroporation in mouse organotypic hippocampal slice culture.</a> Journal of Neuroscience Methods. 337, 108632 (2020).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li><li>Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+synaptic+scaling+induced+by+changes+in+postsynaptic+firing.">Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing.</a> Neuron. 57 (6), 819-826 (2008).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+on+microchips:+the+harmful+effects+of+pH+changes+and+scaling+down.">Electroporation on microchips: the harmful effects of pH changes and scaling down.</a> Science Reports. 5, 17817 (2015).</li><li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+techniques+for+neuronal+cells.">Transfection techniques for neuronal cells.</a> Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).</li><li>Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+manipulate+the+fate+of+single+neural+stem+cells+in+tissue.">A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue.</a> Nature Neurosciences. 15 (2), 329-337 (2011).</li><li>Zhang, Y., Yu, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microinjection+technology+in+cell+biology.">Single-cell microinjection technology in cell biology.</a> Bioessays. 30 (6), 606-610 (2008).</li><li>De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+rat+CA1+neurones+in+acute+versus+organotypic+slices:+role+of+experience+in+synaptic+morphology+and+activity.">Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity.</a> Journal of Physiology. 550, 135-147 (2003).</li></ol>

Yazarlar çıkar çatışmaları olmadığını beyan ederler.

Burada hem uyarıcı hem de inhibitör nöronları yüksek verimlilik ve hassasiyetle transfect eden bir elektroporasyon yöntemini tarif ediyoruz. Optimize edilmiş elektroporasyon protokolümüz, yüksek verimli gen transfeksiyonunu elde etmek için üç yenilikçi atılım gerçekleştirmektedir. İlk modifikasyonumuz pipet boyutunu daha önce yayınlananprotokollerekıyasla artırmaktı 3,5,6. Bu değişiklik, pipet tıkanma...

Moleküler biyolojide, bir araştırmacının en önemli hususlarından biri, işlevini ortaya çıkarmak için bir hücreye veya hücre popülasyonuna ilgi çekici bir genin nasıl teslimılacağıdır. Farklı teslimat yöntemleri biyolojik (örneğin, viral bir vektör), kimyasal (örneğin, kalsiyum fosfat veya lipit) veya fiziksel (örneğin, elektroporasyon, mikroenjeksiyon veya biyoliztik) olarak kategorize edilebilir1,2. Biyolojik yöntemler oldukça verimlidir ve hücre tipine özgü olabilir, ancak spesifik genetik araçların geliştirilmesi ile sınırlıdır. Kimyasal yaklaşımlar çok güçlü in vitrodur, ancak transeksiyonlar genellikle rastgeledir; ayrıca, bu yaklaşımlar çoğunlukla yalnızca birincil hücreler için ayrılmıştır. Fiziksel yaklaşımlar arasında biyolistik teknik açıdan en basit ve en kolay olanıdır, ancak yine nispeten düşük verimlilikte rastgele transfeksiyon sonuçları üretir. Genetik araçlar geliştirmeye gerek kalmadan belirli hücrelere transfer gerektiren uygulamalar için, tek hücreli elektroporasyon3,4'e bakıyoruz.
Elektroporasyon sadece alan elektroporasyonunu ifade etmek için kullanılırken, son yirmi yıl içinde, özgüllüğü ve verimliliği artırmak için çoklu in vitro ve in vivo tek hücreli elektroporasyon protokolleri geliştirilmiştir5,6,7, elektroporasyonun genleri tek tek hücrelere aktarmak için kullanılabileceğini ve bu nedenle son derece hassas olabileceğini göstermiştir. Ancak, prosedürler teknik olarak zorlu, zaman alıcı ve nispeten verimsizdir. Gerçekten de, daha yeni makaleler mekanize elektroporasyon makinelerinin fizibilitesini araştırdı8,9, bu tür robotikleri kurmakla ilgilenen araştırmacılar için bu engellerin birkaçını ortadan kaldırmaya yardımcı olabilir. Ancak daha basit araçlar arayanlar için, elektroporasyon, yani hücre ölümü, transfeksiyon yetmezliği ve pipet tıkanması ile ilgili sorunlar bir endişe olmaya devam ediyor.
Son zamanlarda daha büyük uçlu cam pipetler kullanan bir elektroporasyon yöntemi geliştirdik, daha hafif elektriksel darbe parametreleri ve eksistik nöronlarda önceki yöntemlere göre çok daha yüksek transfeksiyon verimliliği sağlayan ve ilk kez fare organotipik dilim kültürünün hipokampal CA1 bölgesindeki somatostatin ekspresyon inhibitör internöronlar da dahil olmak üzere inhibitör internöronlardaki genleri dönüştürmemizi sağlayan benzersiz bir basınç döngüsü adımı10. Ancak bu elektroporasyon yönteminin farklı inhibitör internöron tiplerinde ve nöronal gelişim evrelerinde güvenilirliği ele alınmamıştır. Burada, bu elektroporasyon tekniğinin genleri hem uyarıcı nöronlara hem de farklı internöron sınıflarına aktarabildiğini gösterdik. Daha da önemlisi, test edilen in vitro (DIV) dilim kültürü yaşı ne olursa olsun transfeksiyon verimliliği yüksekti. Bu yerleşik ve kullanıcı dostu teknik, in vitro fare beyin dokusu bağlamında farklı hücre tipleri için tek hücreli elektroporasyon kullanmak isteyen herhangi bir araştırmacıya şiddetle tavsiye edilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Plasmid preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organotypic slice culture preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Plates</td>
			<td>GREINER BIO-ONE</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>#5/45</td>
			<td>Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCHVU02RE</td>
			<td>Filtration and storage of culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>BD C150-UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td>TED PELLA, INC.</td>
			<td>10180</td>
			<td>Tissue chopper for organotypic slice culture preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert, 30 mm</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PIHP03050</td>
			<td>Organotypic slice culture inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>Precision Systems</td>
			<td>OSMETTE II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE coated spatulas</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>SK-06369-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14958-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Vacuum Filtration System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPT01RE</td>
			<td>Filtration and storage of aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glasses</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipetter Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>Puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Binder</td>
			<td>BD (E2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puller Filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>FB330B</td>
			<td>Puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 mm Falcon Petri Dishes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airtable</td>
			<td>TMC</td>
			<td>63-7512E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Q Imaging</td>
			<td>Retiga-2000DC</td>
			<td>Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation System</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axoporator 800A</td>
			<td>Electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Illumination System</td>
			<td>Prior</td>
			<td>Lumen 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulator</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MPC-385</td>
			<td>Manipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metamorph software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>Dynamax, RP-2</td>
			<td>Perfusion pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shifting Table</td>
			<td>Luigs &#38; Neuman</td>
			<td>240 XY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speaker</td>
			<td>Unknown</td>
			<td></td>
			<td>Speakers connected to the electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table Top Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MIDI 40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX61WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence imaging #2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-One Fluorescence Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X710</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell electroporation across different organotypic slice culture of mouse hippocampal excitatory and class-specific inhibitory neurons

Elektroporasyon, işlevlerini anlamak için belirli genleri hücrelere aktarmak için kritik bir yöntem olarak kendini belirlemiştir. Burada, fare organotipik hipokampal dilim kültüründe uyarıcı ve sınıfa özgü inhibitör nöronlarda in vitro gen transfeksiyonunun verimliliğini (~%80) en üst düzeye çıkaran tek hücreli bir elektroporasyon tekniğini açıklıyoruz. Büyük cam elektrotlar, tetrodotoksin içeren yapay beyin omurilik sıvısı ve hafif elektriksel darbeler kullanarak, kültürlü hipokampal CA1 piramidal nöronlarına ve inhibitör internöronlara ilgi çekici bir gen sunduk. Ayrıca, elektroporasyon, transfeksiyon verimliliğinde herhangi bir azalma olmadan 21 güne kadar kültürlü hipokampal dilimlerde gerçekleştirilebilir ve farklı dilim kültürü gelişim aşamalarının incelenmesine olanak sağlar. Çeşitli hücre tiplerinde genlerin moleküler fonksiyonlarını incelemeye olan ilgi artarken, yöntemimiz fare beyin dokusunda mevcut elektrofizyoloji ekipmanı ve teknikleri ile gerçekleştirilebilen in vitro gen transfeksiyonunda güvenilir ve basit bir yaklaşım göstermektedir.

Tek hücreli elektroporasyonumuz genleri görsel olarak tanımlanmış uyarıcı ve inhibitör nöronlara tam olarak ulaştırabilir. Üç farklı nöronal hücre tiplerini üç farklı zaman noktasında elektropore ettik. Nöronları ifade eden parvalbumin (Pv) veya veziküler glutamat tip 3 (VGT3), sırasıyla Pv/TdTomato ve VGT3/TdTomato hatları olarak adlandırılan TdTomato (kırmızı floresan proteinin bir çeşidi) muhabir hattı (Jax #007905) ile Pv cre (JAX #008069) veya VGT3cre (JAX #018147) çizgi...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons at JoVE.com

Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

Burada sunulan, çeşitli in vitro hipokampal dilim kültürü çağlarında hem uyarıcı hem de inhibitör nöronlarda genler sağlayabilen tek hücreli elektroporasyon için bir protokoldür. Yaklaşımımız, hücre-otonom ve hücreler arası fonksiyonları incelemek için kullanılabilecek tek tek hücrelerdeki genlerin kesin ve verimli bir şekilde ifade edilmesini sağlar.

Fare Hipokampal Uyarıcı ve Sınıfa Özgü inhibitör Nöronların Farklı Organotipik Dilim Kültürü boyunca Tek Hücreli Elektroporasyon

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a ...

single-cell-electroporation-across-different-organotypic-slice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.5K Görüntüleme.  University of Massachusetts Medical School. Burada sunulan, çeşitli in vitro hipokampal dilim kültürü çağlarında hem uyarıcı hem de inhibitör nöronlarda genler sağlayabilen tek hücreli elektroporasyon için bir protokoldür. Yaklaşımımız, hücre-otonom ve hücreler arası fonksiyonları incelemek için kullanılabilecek tek tek hücrelerdeki genlerin kesin ve verimli bir şekilde ifade edilmesini sağlar.

Video: Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

Nöronal Sakatlık incelenmesi için Organotipik Hipokampal Dilim Kültür Modeli

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Nörobilim

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in which the enhanced version of the green fluorescent protein (EGFP) is exclusively expressed in all neurons of the developing central and peripheral nervous system1, allowing the possibility to both film the innervation of the forelimb and to manipulate this process with pharmacological and genetic techniques2. The most critical parameter in the successful cultivation of such slice cultures is the method by which the slices are prepared. After extensive testing of a variety of methods, we have found that a vibratome is the best possible device to slice the embryos such that they routinely result in a culture that demonstrates viability over a period of several days, and most importantly, develops in an age-specific manner. For mid-gestation embryos, this includes the normal outgrowth of spinal nerves from the spinal cord and the dorsal root ganglia to their targets in the periphery and the proper determination of skeletal and muscle tissue. 
In this work, we present a method for processing whole embryos of embryonic day (E) E10 to E12 into 300 - 400 micrometer slices for cultivation in a standard tissue culture incubator, which can be studied for up to two days after slice preparation. Critical for the success of this approach is the use of a vibratome to slice each agarose-embedded embryo. This is followed by the cultivation of the slices upon Millicell culture membrane inserts placed upon a small volume of medium, resulting in an interface culture technique. One litter with an average of 7 embryos routinely produces at least 14 slices (2-3 slices of the forelimb region per embryo), which varies slightly due to the age of the embryos as well as to the thickness of the slices. About 80% of the cultured slices show nerve outgrowth, which can be measured througout the culturing period2. Representative results using the tauGFP mouse line are demonstrated.

We present a method to prepare organotypic slices of mid-gestation mouse embryos for the cultivation and time-lapse imaging of peripheral nerve outgrowth.

Organotipik Dilim Kültür GFP-Periferik Sinir akıbet Gerçek zamanlı Görüntüleme Fare Embriyolar ifade

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Embriyonik Fare Hipokampal ve Kortikal nöronlar primer Nucleofection ve Kültür

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotipik Hipokampal Dilim Kültürler

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Prenatal Fareler gelen Hipokampal Nöronlar izolasyonu ve Kültürü

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Fare dopaminerjik nöronlar İlköğretim Kültür

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Organotipik Dilim Kültürler Oligodendrosit Dinamikler ve miyelinasyonun incelemek için

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Organotipik Hipokampal Dilimleri eşleştirilmiş Tüm Hücre Kayıtlar

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

Içinde Neurovascular Yaptırma Analizi Entorhino-hipokampal Organotipik Dilim Kültürler

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. This model is suitable for addressing different research questions that involve studies on neuroprotection, electrophysiological experiments on neurons, neuronal networks or tumor invasion. The hippocampal architecture and neuronal activity in multisynaptic circuits are well conserved in OHSC, even though the slicing procedure itself initially lesions and leads to formation of a glial scar. The scar formation alters presumably the mechanical properties and diffusive behavior of small molecules, etc. Slices allow the monitoring of time dependent processes after brain injury without animal surgery, and studies on interactions between various brain-derived cell types, namely astrocytes, microglia and neurons under both physiological and pathological conditions. An ambivalent aspect of this model is the absence of blood flow and immune blood cells. During the progression of the neuronal injury, migrating immune cells from the blood play an important role. As those cells are missing in slices, the intrinsic processes in the culture may be observed without external interference. Moreover, in OHSC the composition of the medium-external environment is precisely controlled. A further advantage of this method is the lower number of sacrificed animals compared to standard preparations. Several OHSC can be obtained from one animal making simultaneous studies with multiple treatments in one animal possible. For these reasons, OHSC are well suited to analyze the effects of new protective therapeutics after tissue damage or during tumor invasion. 
The protocol presented here describes a preparation method of OHSC that allows generating highly reproducible, well preserved slices that can be used for a variety of experimental research, like neuroprotection or tumor invasion studies.

Organotypic hippocampal slice cultures (OHSC) represent an in vitro model that simulates the in vivo situation very well. Here we describe a vibratome-based improved slicing protocol to obtain high quality slices for use in assessing the neuroprotective potential of novel substances or the biological behavior of tumor cells.

Organotypic Hipokampal dilim kültürler çalışma Neuroprotection ve tümör hücrelerinin Invasiveness Model olarak

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...