この研究は、国立衛生補助金研究所(K.F.、T32 GM107000、F30MH122146からA.C.)によって支援されました。著者らは、渡辺直e氏に対し、技術面の技術支援に対し、感謝の気持ちを伝える。

すべての動物の議定書は、マサチューセッツ大学医学部の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって見直され、承認されました。スライス培養製剤、プラスミド調製、およびエレクトロポレーションも以前に公開された方法で詳述されており、追加情報10について参照することができる。
1. スライス文化の準備
<ol><li>前に説明したようにマウスのorganotypic海馬スライス培養を準備します11,いずれかの性別の出生後6〜7日齢のマウスを使用して.<ol>
<li>(mM)からなるorganotypicスライス培養のための解剖培地を準備する:238スクロース、2.5 KCl、1 CaCl2、4MgCl2、26NaHCO3、1NaH2PO4、および11グルコースを脱イオン水で、5%CO2 /95%O2でガス7.4のpHにする。</li>
		<li>78.8%(v/v)最小必須培地イーグル、20%(v/v)馬血清、17.9 mM NaHCO 3、26.6 mMグルコース、2 M CaCl2、2M MgSO4、30mM HEPES、インスリン(1μg/mL)、および0.06mMからなるorganotipicスライス培地を調製します。オスマメーターを使用して310-330オスモルにオスモルを調整します。</li>
		<li>2つのスパチュラを使用して脳全体からカバピを解剖し、組織チョッパーを使用してスライス(400 μm)します。2つの鉗子を使用してスライスを分離し、挿入物の下に培養培地(950 μL)で満たされた6ウェルプレートの30mm細胞培養インサートに移す。</li>
	</ol>
</li>
	<li>組織培養インキュベーター(35°C、5%CO2)にオルガノミクススライス培養物を保存し、2日ごとにスライス培養培地を交換します。</li>
</ol>2. プラスミド製剤
<ol><li>目的の遺伝子のプラスミドを準備します。<ol>
<li>亜クローンは、pCAGベクターに緑色蛍光タンパク質(EGFP)遺伝子を増強した。</li>
		<li>pCAG-EGFPプラスミドを内毒素を含まない精製キットで精製し、140 mM Kメタンスルホン酸、0.2 mM EGTA、2 mMMgCl2、および10 mM HEPESを含むジエチルパイロカーボネート処理水で構成される内部溶液に溶解し、PH 7.3に調整してKOH(プラミド濃度:0μG)を使用してpH 7.3に調整します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ガラスピペットの準備
<ol><li>マイクロピペットの引き手にホウケイ酸ガラスピペット(4.5~8 MΩ)を引き出す(図1A)。 メモ:全セルパッチクランプ記録に使用されるガラスピペットは、エレクトロポレーションに最適です。</li>
	<li>ガラスピペットを200°Cで一晩焼いて殺菌します。</li>
	<li>解剖顕微鏡の下でピペットチップのサイズを確認し、電気抵抗を近似します。<ol>
<li>オプション:ピペットをエレクトロポレーション電極に取り付けてピペットの抵抗を確認し、マイクロマニピュレータを使用してピペットチップをフィルター滅菌人工脳脊髄液(aCSF)に操縦します(mM単位):119 NaCl、 2.5 KCl, 0.5 CaCl2,5 MgCl2,26 NaHCO3,1 NaH2PO4 および 11 脱イオン水中の 11 グルコース, 5% CO2/95% O2 をガス化し、 7.4.エレクトロポレーターの読み出しを使用して実際の抵抗を確認します。 メモ:ピペットチップが鋭くないほど、電気抵抗が大きくなります。ピペットの抵抗は10 MΩ以下でなければなりません。ピペット抵抗の高いガラスピペット(図1B)は、エレクトロポレーションを繰り返す際に先端に詰まることがよくあります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. エレクトロポレーションリグのセットアップ
<ol><li>エレクトロポレーターを標準的な全細胞電気生理学リグに取り付け、マイクロマニピュレーターと蠕動ポンプを備えたシフトテーブルに取り付けられた直立した顕微鏡を装備します。</li>
	<li>エレクトロポレーターのヘッドステージをマイクロマニピュレーターに取り付け、一対のスピーカーをエレクトロポレーターに接続します。エレクトロポレーターをフットペダルに接続し、準備ができたらパルスを送ることができます。 メモ:スピーカーは電源を入れるとトーンを発しますが、これは電極の電気抵抗の指標です。これにより、手順から注意を引くことなく、抵抗の相対的な変化を決定することが可能になります。</li>
</ol>5. エレクトロポレーションの準備
<ol><li>6ウェルプレートから3cmのペトリ皿にスライス培養インサートを移し、900 μLの培養培地を積み込み、エレクトロポレーションを行う準備ができるまでテーブルトップCO2 インキュベーターに保管します。<ol>
<li>3.5cmのペトリ皿中にスライス培養培地(1mL)を入れたフレッシュカルチャーインサートをエレクトロポレーション後の培養スライスに30分以上入れます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>電気ポレーションのためにリグをきれいにして準備します。<ol>
<li>1日の実験を開始する前にチューブとチャンバーを殺菌するために5分間10%の漂白剤でラインを浸透させます。</li>
		<li>少なくとも30分間、脱イオン化されたオートクレーブ水でラインを浸透させ、完全にすすい水を洗い流します。</li>
		<li>0.001 mMテトロドトキシン(TTX)を含むフィルター滅菌aCSFでラインを浸透します。 注:TTXは、インターニューロン10の過剰励起による細胞毒性および死を最小限に抑える。</li>
	</ol>
</li>
	<li>エレクトロポレーターのパルスパラメータを設定:–5 Vの振幅、四角パルス、500ミリ秒の列車、50Hzの周波数、および500 μsのパルス幅。</li>
	<li>プラスミド含有内部溶液を5 μL充填します。<ol>
<li>ピペットチップから閉じ込められた気泡をフリックして、先端を何度も軽くタップして取り除きます。</li>
		<li>解剖顕微鏡の下で視覚化するか、ステップ3.3.1を繰り返してピペットの抵抗を確認して、チップの損傷を確認します。 注:先端が破損している場合、ガラスピペットを廃棄する必要があり、このステップは、手順3で以前に準備した新しいガラスピペットで繰り返す必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ピペットチップを電極にしっかりと取り付け、スピーカーの電源を入れます。先端がaCSF媒体と接触した時にエレクトロポレーターの読み出し(ピペットの抵抗)を記録します。</li>
	<li>鋭い刃を使用して培養インサート膜を切断し、1つのスライス培養を分離する。鋭角鉗子を使用して慎重にスライス培養液をエレクトロポレーションチャンバーに移し、スライスアンカーで位置を固定します。<ol>
<li>神経の健康や機能12の変化などの副作用を防ぐために、一度に30分以上、培養器の外側にスライス培養を保管しないでください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 目的のセルを電気ポレート
<ol><li>口でピペットに正圧を加える、またはチューブに取り付けられた1 mLシリンジ(0.2-0.5 mL圧)を使用して下さい。</li>
	<li>マイクロマニピュレーターの3次元ノブコントロールを使用して、スライス培養の表面付近でピペットチップを操作します。</li>
	<li>ターゲットセルを選択して近づき、顕微鏡で見える細胞表面にディンプルが形成されるまで正の圧力を加えます。</li>
	<li>圧力サイクルを実行します。<ol>
<li>口で軽度の陰圧を速やかに加えて、ピペット先端と血漿膜の間に緩いシールが形成されるように、膜がピペット先端に幾分上がって視覚的に示される。スピーカーからの音の増加を聞いてピペット抵抗の増加(約2.5倍の初期抵抗)を観察してください。ディンプルが再形成されるように、すぐに正の圧力を再適用します。</li>
		<li>一時停止せずに少なくとも2回以上の圧力サイクルをすぐに完了し、1sの負圧を保持します。 注:サイクル間の一時停止、圧力の適用が多すぎる、または負圧を長く保持すると、細胞の損傷が大きく、エレクトロポレーション中に細胞が死ぬ可能性があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>スピーカーからの音がピッチの安定した頂点に達したときに、フットペダルを使用してエレクトロポレーターを一度素早くパルスし、電気抵抗のピークを示します。パルスを送信する前に、1s以上のピーク抵抗で待たないでください。 注: このプロトコル10を使用する場合、オフターゲットエレクトロポレーションは見当違いです。圧力サイクル中にガラスピペットと接触した細胞のみがトランスフェクションされた。他のニューロンの近くにピペットを配置しても遺伝子トランスフェクションは起こらない。</li>
	<li>圧力をかけることなく、約100μmのピペットをセルから緩やかに引き込みます。</li>
	<li>正圧を再適用し、抵抗がステップ5.5で記録された読み出しと類似していることを確認し、次のセルに近づく。<ol>
<li>ポテンシャルな下駄を除去し、視覚的に示されたか、またはエレクトロポレーション後にピペット抵抗を有意に増加させた(>15%高く)、正の圧力を加えることによって除去する。 注:目に見える詰まりがなく、抵抗がまだかなり高い場合は、ピペットを捨てて新しいものを使用してください。平均して、ユーザーが注意して10を使用している場合、ピペットは最大20のエレクトロポレーションイベントに使用できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>エレクトロポレーション後、スライス培養液を新鮮な培養インサートに移し、35°Cで最大3日間インキュベーターでインキュベートします。</li>
</ol>7. 組織の海馬スライス培養物の固定、染色、イメージング
<ol><li>エレクトロポレートされたオルガノミピックスライス培養2– トランスフェクション後2–3日、0.01 Mリン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)で4%パラホルムアルデヒドと4%スクロースを室温で1.5時間修正します。</li>
	<li>固定液を取り除き、0.1 Mリン酸バッファー(1x PB)で30%スクロースでスライスを2時間インキュベートします。</li>
	<li>スライドグラスの上にスライスを置き、砕いたドライアイスの上にスライドグラスを置くことによってそれらを凍結します。スライスを室温で解凍し、1x PBSで満たされた6ウェルプレートに移します。</li>
	<li>GDBバッファー(0.1%ゼラチン、0.3%トリトンX-100、450 mM NaCl、および32%1x PB、pH 7.4)のマウス抗GFPおよびウサギ抗RFP抗体でスライスを室温で2時間染色します。</li>
	<li>1回のPBSでスライスを室温で3回洗浄し、各洗浄10分間おきます。</li>
	<li>抗マウスAlexa 488-コンジュゲート二次抗体と抗ウサギAlexa 594-共役二次抗体をGDBバッファー内で1時間室温でインキュベートスライス。DAPI(4 μg/mL)を1x PBSで室温で10分間インキュベートします。</li>
	<li>1回PBSでスライスを室温で3回洗浄し、各洗浄を3分間行います。</li>
	<li>取り付け媒体を使用してガラススライドにスライスを取り付け、蛍光イメージングを行います。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Washbourne, P., McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+gene+transfer+into+neurons.">Techniques for gene transfer into neurons.</a> Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 566-573 (2002).</li><li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+by+direct+microinjection+of+DNA+into+cultured+mammalian+cells.">High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells.</a> Cell. 22 (2), 479-488 (1980).</li><li>Rae, J. L., Levis, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+electroporation.">Single-cell electroporation.</a> Pflugers Archives: European Journal of Physiology. 443 (4), 664-670 (2002).</li><li>Teruel, M. N., Blanpied, T. A., Shen, K., Augustine, G. J., Meyer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+microporation+technique+for+the+transfection+of+cultured+CNS+neurons.">A versatile microporation technique for the transfection of cultured CNS neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 93 (1), 37-48 (1999).</li><li>Rathenberg, J., Nevian, T., Witzemann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transfection+of+individual+neurons+using+modified+electrophysiology+techniques.">High-efficiency transfection of individual neurons using modified electrophysiology techniques.</a> Journal of Neuroscience Methods. 126 (1), 91-98 (2003).</li><li>Tanaka, M., Yanagawa, Y., Hirashima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+small+interfering+RNA+by+single-cell+electroporation+in+cerebellar+cell+cultures.">Transfer of small interfering RNA by single-cell electroporation in cerebellar cell cultures.</a> Journal of Neuroscience Methods. 178 (1), 80-86 (2009).</li><li>Wiegert, J. S., Gee, C. E., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Electroporation+of+Neurons.">Single-Cell Electroporation of Neurons.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (2), 094904 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robot+for+high+yield+electrophysiology+and+morphology+of+single+neurons+in+vivo.">A robot for high yield electrophysiology and morphology of single neurons in vivo.</a> Nature Communication. 8, 15604 (2017).</li><li>Steinmeyer, J. D., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+manipulation+in+brain+tissue.">High-throughput single-cell manipulation in brain tissue.</a> PLoS One. 7 (4), 35603 (2012).</li><li>Keener, D. G., Cheung, A., Futai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+method+for+single-cell+electroporation+in+mouse+organotypic+hippocampal+slice+culture.">A highly efficient method for single-cell electroporation in mouse organotypic hippocampal slice culture.</a> Journal of Neuroscience Methods. 337, 108632 (2020).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li><li>Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+manipulate+the+fate+of+single+neural+stem+cells+in+tissue.">A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue.</a> Nature Neurosciences. 15 (2), 329-337 (2011).</li><li>Zhang, Y., Yu, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microinjection+technology+in+cell+biology.">Single-cell microinjection technology in cell biology.</a> Bioessays. 30 (6), 606-610 (2008).</li><li>De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+rat+CA1+neurones+in+acute+versus+organotypic+slices:+role+of+experience+in+synaptic+morphology+and+activity.">Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity.</a> Journal of Physiology. 550, 135-147 (2003).</li></ol>

著者らは、利益相反はないと宣言している。

ここでは、励起性ニューロンと阻害性ニューロンの両方を高効率かつ高精度にトランスフェクトするエレクトロポレーション法について説明する。当社の最適化エレクトロポレーションプロトコルは、高効率遺伝子トランスフェクションを実現するための3つの革新的なブレークスルーを有しています。私たちの最初の変更は、以前に公開されたプロトコル3、5、6<sup...

分子生物学では、研究者にとって最も重要な考慮事項の1つは、その機能を解明するために細胞または細胞の集団に関心のある遺伝子を送達する方法です。異なる送達方法は、生物学的(例えば、ウイルスベクター)、化学的(例えば、リン酸カルシウムまたは脂質)、または物理的(例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、またはバイオリストクス)1、2のいずれかに分類することができる。生物学的方法は高効率で、細胞種に特異的であるが、特定の遺伝的ツールの開発によって制限される。化学アプローチは、インビトロでは非常に強力ですが、トランスフェクションは一般的にランダムです。さらに、これらのアプローチは主にプライマリセル専用です。物理的アプローチの中で、バイオリスティクスは技術的な観点から最も簡単で最も簡単ですが、再び比較的低い効率でランダムトランスフェクション結果を生成します。遺伝的ツールを開発する必要なく特定の細胞への転送を必要とするアプリケーションについては、単一細胞エレクトロポレーション3、4に目を向けます。
エレクトロポレーションはフィールドエレクトロポレーションのみを指していたのに対し、過去20年間に、特異性と効率を向上させるために複数のin vitroおよびin vivo単一細胞エレクトロポレーションプロトコルが開発され、エレクトロポレーションが遺伝子を個々の細胞に移すことができることを実証し、したがって、非常に正確であることが実証されています。しかし、この手順は技術的に要求が厳しく、時間がかかり、比較的非効率的です。実際、最近の論文では、機械化されたエレクトロポレーションリグ8,9の実現可能性を調査しており、このようなロボット工学の設置に興味を持つ研究者にとってこれらの障壁のいくつかを排除するのに役立ちます。しかし、より単純な手段を探している人にとって、エレクトロポレーション、すなわち細胞死、トランスフェクション障害、ピペット詰まりの問題は依然として懸念される。
我々は最近、より大きな先端ガラスピペット、穏やかな電気パルスパラメータ、および以前の方法よりもはるかに高い経道ニューロンのトランスフェクション効率を生成するユニークな圧力サイクリングステップを使用するエレクトロポレーション法を開発し、ソマトスタチン発現阻害性インターニューロンを含む阻害ニューロンインターニューロンの遺伝子を初めてトランスフェクトすることを可能にした。しかしながら、異なる阻害性インターニューロン型および神経細胞発生段階におけるこのエレクトロポレーション法の信頼性は取り上げられていない。ここでは、このエレクトロポレーション技術が、興奮性ニューロンおよび異なるクラスのインターニューロンの両方に遺伝子をトランスフェクトできることを実証した。重要なことに、試験したインビトロ(DIV)スライス培養年齢に関係なく、トランスフェクション効率が高かった。この確立されたユーザーフレンドリーな技術は、インビトロマウス脳組織の文脈で異なる細胞タイプの単細胞エレクトロポレーションを使用することに興味のある研究者に強くお勧めします。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Plasmid preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organotypic slice culture preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Plates</td>
			<td>GREINER BIO-ONE</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>#5/45</td>
			<td>Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCHVU02RE</td>
			<td>Filtration and storage of culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>BD C150-UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td>TED PELLA, INC.</td>
			<td>10180</td>
			<td>Tissue chopper for organotypic slice culture preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert, 30 mm</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PIHP03050</td>
			<td>Organotypic slice culture inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>Precision Systems</td>
			<td>OSMETTE II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE coated spatulas</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>SK-06369-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14958-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Vacuum Filtration System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPT01RE</td>
			<td>Filtration and storage of aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glasses</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipetter Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>Puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Binder</td>
			<td>BD (E2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puller Filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>FB330B</td>
			<td>Puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 mm Falcon Petri Dishes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airtable</td>
			<td>TMC</td>
			<td>63-7512E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Q Imaging</td>
			<td>Retiga-2000DC</td>
			<td>Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation System</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axoporator 800A</td>
			<td>Electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Illumination System</td>
			<td>Prior</td>
			<td>Lumen 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulator</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MPC-385</td>
			<td>Manipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metamorph software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>Dynamax, RP-2</td>
			<td>Perfusion pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shifting Table</td>
			<td>Luigs &#38; Neuman</td>
			<td>240 XY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speaker</td>
			<td>Unknown</td>
			<td></td>
			<td>Speakers connected to the electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table Top Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MIDI 40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX61WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence imaging #2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-One Fluorescence Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X710</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell electroporation across different organotypic slice culture of mouse hippocampal excitatory and class-specific inhibitory neurons

エレクトロポレーションは、特定の遺伝子を細胞に移してその機能を理解するための重要な方法としての確立を確立しました。ここでは、マウスの組織性海馬スライス培養における興奮性およびクラス特異的阻害ニューロンにおけるインビトロ遺伝子トランスフェクションの効率(約80%)を最大化する単細胞エレクトロポレーション技術について述べている。大きなガラス電極、テトロドトキシン含有人工脳脊髄液および軽度の電気パルスを用いて、培養海馬CA1錐体ニューロンおよび阻害性インターニューロンに関心のある遺伝子を送達した。さらに、エレクトロポレーションは、トランスフェクション効率の低下を伴う21日間までの培養海馬スライスで行うことができ、様々なスライス培養の発達段階の研究を可能にする。多様な細胞型にわたって遺伝子の分子機能を調べることに関心が高まる中、既存の電気生理学装置や技術で行うことができるマウス脳組織におけるインビトロ遺伝子トランスフェクションに対する信頼できる簡単なアプローチを実証しています。

当社の単細胞エレクトロポレーションは、視覚に同定された興奮性および抑制性ニューロンに遺伝子を正確に送達することができる。3つの異なる時間ポイントで3つの異なるニューロン細胞タイプを電気ポポレートしました。パーブアルブミン(Pv)またはベシキュラーグルタミン酸3型(VGT3)発現ニューロンを、それぞれPv/TdTomatoとVGT3/TdTomatoラインと呼ばれるTdTomato(赤蛍光タンパク質の変種)レポ?...

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Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

ここで提示される単細胞エレクトロポレーションのためのプロトコルは、体外海馬スライス培養年代の範囲にわたって興奮性および阻害性ニューロンの両方の遺伝子を送達することができる。このアプローチは、細胞自律機能や細胞間機能を調べるために使用できる個々の細胞内の遺伝子の正確かつ効率的な発現を提供します。

マウス海馬興奮性およびクラス特異的阻害ニューロンの異なるorganotypics Slice培養における単細胞エレクトロポレーション

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.5K ビュー.  University of Massachusetts Medical School. ここで提示される単細胞エレクトロポレーションのためのプロトコルは、体外海馬スライス培養年代の範囲にわたって興奮性および阻害性ニューロンの両方の遺伝子を送達することができる。このアプローチは、細胞自律機能や細胞間機能を調べるために使用できる個々の細胞内の遺伝子の正確かつ効率的な発現を提供します。

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The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

神経損傷を調べるための器官型海馬スライス培養モデル

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

神経科学

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in which the enhanced version of the green fluorescent protein (EGFP) is exclusively expressed in all neurons of the developing central and peripheral nervous system1, allowing the possibility to both film the innervation of the forelimb and to manipulate this process with pharmacological and genetic techniques2. The most critical parameter in the successful cultivation of such slice cultures is the method by which the slices are prepared. After extensive testing of a variety of methods, we have found that a vibratome is the best possible device to slice the embryos such that they routinely result in a culture that demonstrates viability over a period of several days, and most importantly, develops in an age-specific manner. For mid-gestation embryos, this includes the normal outgrowth of spinal nerves from the spinal cord and the dorsal root ganglia to their targets in the periphery and the proper determination of skeletal and muscle tissue. 
In this work, we present a method for processing whole embryos of embryonic day (E) E10 to E12 into 300 - 400 micrometer slices for cultivation in a standard tissue culture incubator, which can be studied for up to two days after slice preparation. Critical for the success of this approach is the use of a vibratome to slice each agarose-embedded embryo. This is followed by the cultivation of the slices upon Millicell culture membrane inserts placed upon a small volume of medium, resulting in an interface culture technique. One litter with an average of 7 embryos routinely produces at least 14 slices (2-3 slices of the forelimb region per embryo), which varies slightly due to the age of the embryos as well as to the thickness of the slices. About 80% of the cultured slices show nerve outgrowth, which can be measured througout the culturing period2. Representative results using the tauGFP mouse line are demonstrated.

We present a method to prepare organotypic slices of mid-gestation mouse embryos for the cultivation and time-lapse imaging of peripheral nerve outgrowth.

末梢神経突起伸長のリアルタイムイメージングのためのGFP発現マウス胚の器官型スライス培養

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofectionとマウス胎児海馬および皮質ニューロンの初代培養

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

器官型海馬切片培養

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

胎児マウスから海馬ニューロンの単離および培養

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

マウスドーパミン作動性ニューロンの初代培養

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

オリゴデンドロサイトダイナミクスと髄鞘形成を研究するための器官型スライス培養

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

器官型海馬スライスにおけるペア全細胞記録

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

Entorhino海馬器官型スライス培養における神経血管リモデリングの解析

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. This model is suitable for addressing different research questions that involve studies on neuroprotection, electrophysiological experiments on neurons, neuronal networks or tumor invasion. The hippocampal architecture and neuronal activity in multisynaptic circuits are well conserved in OHSC, even though the slicing procedure itself initially lesions and leads to formation of a glial scar. The scar formation alters presumably the mechanical properties and diffusive behavior of small molecules, etc. Slices allow the monitoring of time dependent processes after brain injury without animal surgery, and studies on interactions between various brain-derived cell types, namely astrocytes, microglia and neurons under both physiological and pathological conditions. An ambivalent aspect of this model is the absence of blood flow and immune blood cells. During the progression of the neuronal injury, migrating immune cells from the blood play an important role. As those cells are missing in slices, the intrinsic processes in the culture may be observed without external interference. Moreover, in OHSC the composition of the medium-external environment is precisely controlled. A further advantage of this method is the lower number of sacrificed animals compared to standard preparations. Several OHSC can be obtained from one animal making simultaneous studies with multiple treatments in one animal possible. For these reasons, OHSC are well suited to analyze the effects of new protective therapeutics after tissue damage or during tumor invasion. 
The protocol presented here describes a preparation method of OHSC that allows generating highly reproducible, well preserved slices that can be used for a variety of experimental research, like neuroprotection or tumor invasion studies.

Organotypic hippocampal slice cultures (OHSC) represent an in vitro model that simulates the in vivo situation very well. Here we describe a vibratome-based improved slicing protocol to obtain high quality slices for use in assessing the neuroprotective potential of novel substances or the biological behavior of tumor cells.

研究保護および腫瘍細胞の侵襲性をモデルとして脊髄海馬スライス培養

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...