Vorremmo ringraziare la dott.ssa Julia Fine per le sue idee e discussioni durante il processo di creazione del protocollo, così come la dott.ssa Cassondra Vernier per i suoi utili commenti durante l'editing. Questi materiali hanno contribuito a progetti che sono stati sostenuti in parte dalla Foundation for Food and Agriculture Research, nell'ambito della sovvenzione ID 549025.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui abbiamo delineato metodi che descrivono in dettaglio ogni fase del processo di amplificazione del virus e di preparazione dello stock di inoculo, compresa la raccolta delle larve e la propagazione, l'estrazione e la concentrazione del virus, nonché il trattamento virale sotto forma di esperimenti di alimentazione in gabbia. Questi metodi consentono la produzione di particelle virali semi-pure (Figura 4), la cui efficacia può essere costantemente quantificata mediante test di mortalità...

Le api mellifere (Apis mellifera) svolgono un ruolo fondamentale nel moderno paesaggio agricolo globale, ma attualmente soffrono di una combinazione di fattori di stress biotici e abiotici, tra cui esposizione a pesticidi, foraggio scadente, parassiti e agenti patogeni 1,2. Uno dei più importanti agenti patogeni di preoccupazione sono i virus, molti dei quali sono vettorizzati da un altro dei principali fattori di stress delle api da miele, l'acaro parassita Varroa (Varroa destructor). Questi virus possono causare una serie di effetti negativi nelle api mellifere tra cui una ridotta sopravvivenza della covata, difetti dello sviluppo e paralisi che possono portare al collasso totale dell'alveare sia prima che dopo i periodi di svernamento 3,4,5. Sebbene ci siano stati progressi promettenti nello sviluppo di tecnologie utilizzate per combattere l'infezione da virus 6,7,8,9, le dinamiche con cui molti virus si propagano, si diffondono e interagiscono all'interno di un'ape o colonia di miele sono ancora poco conosciute 5,10 . Comprendere la biologia di base delle interazioni tra api e virus e le loro relazioni con altri fattori ambientali è fondamentale per lo sviluppo di tecniche efficaci di gestione dei virus.
Tuttavia, lo studio delle interazioni tra api e virus del miele pone sfide con numerosi fattori noti e sconosciuti che complicano il processo. Questi includono interazioni con la dieta11,12, esposizione ai pesticidi13 e background genetico delle api14,15. Anche quando ci si concentra solo sull'infezione da virus, le complicazioni sono comuni perché le popolazioni di api da miele, sia gestite che selvatiche, hanno sempre un certo grado di infezione da virus di fondo, anche se spesso senza manifestare sintomiacuti 16,17, e gli effetti della coinfezione da virus non sono ben compresi18. Ciò ha reso difficile districare lo studio degli effetti del virus delle api da miele.
Molti studi sul virus delle api da miele hanno utilizzato infezioni virali circostanziali per cercare interazioni con altri fattori di stress, osservando come le infezioni di fondo cambiano con altri trattamenti 12,19,20,21. Mentre questo approccio ha avuto successo nell'identificare effetti importanti, in particolare scoprendo come i pesticidi o i trattamenti dietetici influenzano i livelli e la replicazione del virus, l'inoculazione con un trattamento del virus di contenuto e concentrazione noti è fondamentale per i test sperimentali delle dinamiche di infezione da virus. Anche così, separare il trattamento sperimentale dall'infezione di fondo può anche porre delle sfide. Negli studi sul campo, i ricercatori hanno differenziato i ceppi del virus dell'ala deformata (DWV) per fornire prove della trasmissione del virus dalle api mellifere ai bombi22, ma l'uso di questo approccio sarebbe difficile solo all'interno delle api da miele. I cloni infettivi da virus sono uno strumento potente, non solo per il monitoraggio dell'infezione 23,24,25, ma per studi di genetica inversa sui virus delle api da miele e per la ricerca sull'interazione virus-ospite 26,27,28. Tuttavia, nella maggior parte dei casi, i cloni infettivi sono ancora necessari per soddisfare il ciclo di infezione all'interno delle cellule per produrre particelle. Tali particelle sono preferite come inoculi per trattamenti sperimentali perché la loro infettività è superiore all'RNA virale nudo e l'inoculazione con genomi incapsulati imita un'infezione naturale.
Anche la produzione di inoculi puri e incontaminati del virus delle api del miele (ceppi virali selvatici o derivati da cloni infettivi) pone delle sfide. Questi sono principalmente dovuti alle difficoltà nell'ottenere una linea cellulare di api da miele affidabile, a replicazione continua e priva di virus per produrre virus di ceppo puro29,30. Mentre alcune linee cellulari sono state prodotte, questi sistemi rimangono imperfetti; tuttavia, c'è la speranza che una linea cellulare praticabile possa essere prodotta29, il che consentirebbe un controllo più preciso della produzione e dell'indagine del virus. Fino a quando tale linea non sarà ampiamente disponibile, la maggior parte dei protocolli di produzione di virus continuerà a fare affidamento sull'uso della produzione e purificazione di virus in vivo 18,31,32,33,34. Questi approcci comportano l'identificazione e la purificazione di particelle virali di interesse (o la produzione di un clone infettivo) e il loro utilizzo per infettare le api da miele, di solito come pupe. Le pupe vengono iniettate con il virus bersaglio e poi sacrificate, e ulteriori particelle vengono estratte e purificate. Tuttavia, poiché nessuna ape è priva di virus per cominciare, c'è sempre un certo grado di contaminazione da tracce di altri virus in qualsiasi concentrato di questo tipo e, pertanto, è necessario prestare molta attenzione nella scelta delle api con una bassa probabilità di infezioni di fondo. Inoltre, i metodi per rimuovere le pupe dalle cellule del pettine per l'uso in questi protocolli33 sono molto laboriosi e possono indurre stress nelle api, limitando la produzione con questi mezzi18,32. Qui, riportiamo un metodo alternativo che consente la rimozione su larga scala delle larve con poco lavoro e meno stress meccanico sulle api.
Una volta ottenute le pupe e iniettate con l'inoculo del virus di partenza, devono essere incubate per fornire al virus il tempo di replicarsi. Successivamente, le particelle virali prodotte possono essere trasformate in una forma utilizzabile per infettare le api sperimentali. Esistono diversi metodi semplici per raggiungere questo obiettivo, tra cui l'utilizzo di un omogeneizzato grezzo35,36 o emolinfa generata da api infette viralmente come fonte di infezione37. Questi metodi sono efficaci ma incontrano una maggiore possibilità di introdurre variabili sconosciute dal substrato di fondo (ad esempio, altri fattori negli omogeneizzati delle api morte). Inoltre, è auspicabile concentrare le particelle se un esperimento richiede di somministrare una dose ampia e nota di un virus in un breve periodo di tempo. Pertanto, per un migliore controllo, è preferibile utilizzare metodi che consentano un certo livello di purificazione e concentrazione delle particelle virali. Generalmente, una serie di fasi di precipitazione e centrifugazione comporterà la rimozione di quasi tutto il possibile materiale virale non bersaglio33.
Dopo aver prodotto questo inoculo concentrato, è utile quantificare i titoli virali (qPCR) e caratterizzarlo con biosaggi in vivo per testarne la vitalità e la capacità di causare mortalità, nonché per confermare che si ottengono titoli virali aumentati dopo l'infezione. Ciò può essere ottenuto attraverso esperimenti di iniezione (sia in pupe che in adulti) o esperimenti di alimentazione (in larve o adulti). Mentre tutti questi approcci sono possibili, l'alimentazione di gruppi di api adulte in una gabbia è spesso la più veloce e semplice. Il metodo di analisi della gabbia è anche ampiamente utilizzato per testare vari altri trattamenti sulle api, tra cui la tossicità dei pesticidi38, lo sviluppo dell'ovaio39 e l'influenza nutrizionale sul comportamento40,41 e, quindi, può costituire una buona base per esperimenti che collegano l'infezione da virus con altri fattori42.
Qui descriviamo un metodo affidabile per produrre grandi quantità di particelle virali semi-pure e altamente arricchite senza utilizzare un costoso ultracentrifuga, incluso un metodo per rimuovere le pupe che riduce il lavoro e lo stress meccanico sulle api e un biotest altamente ripetibile e ad alto rendimento per testare l'infezione virale e gli effetti. Controllando strettamente la purezza dell'inoculo virale, i ricercatori sono in grado di ridurre la variazione della risposta virale delle api da miele rispetto ad altri metodi di inoculazione virale. Inoltre, il biotest può schermare gli effetti virali a livello di piccoli gruppi utilizzando unità sperimentali altamente ripetibili prima di scalare su impostazioni realistiche sul campo, che è molto più laborioso da gestire. In combinazione, questi due metodi forniscono gli strumenti necessari per gli studi che possono aiutare a migliorare la nostra comprensione generale delle interazioni fisiologiche ape-virus del miele.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% bleach solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24:1 chloroform:isoamyl alcohol</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>C0549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cages for bioassay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dependent on experimental setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitips Advanced 0.1 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089405</td>
			<td>Optional (if no injector appartus is available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Containers for larval self-removal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Should measure roughly 19&#34; x 9-1/8&#34; (Langstroth deep frame dimensions)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of maintaining 34 &#186;C and 50% relative humidity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>Any absorbent wipe will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium-sized weight boats</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Serve as inoculum trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcon-100kDa with Biomax membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>MPE100025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>P5119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 8000 (PEG)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>1546605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of 15,000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of 21,000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater M4 Multipipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000322</td>
			<td>Optional (if no injector appartus is available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7000TS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse-free water</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>T1375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of virus-enriched inoculum for oral infection of honey bees (apis mellifera)

Le api da miele sono di grande importanza ecologica e agricola in tutto il mondo, ma sono anche soggette a una varietà di pressioni che influenzano negativamente la salute delle api, compresa l'esposizione a patogeni virali. Tali virus possono causare un'ampia varietà di effetti devastanti e spesso possono essere difficili da studiare a causa di molteplici fattori che rendono difficile separare gli effetti dei trattamenti sperimentali dall'infezione di fondo preesistente. Qui presentiamo un metodo per produrre in serie grandi quantità di particelle virali insieme a un biotest ad alto rendimento per testare l'infezione virale e gli effetti. Rese necessarie dall'attuale mancanza di una linea continua di cellule di api da miele prive di virus, le particelle virali vengono amplificate in vivo utilizzando pupe di api da miele, che vengono estratte dall'alveare in grandi volumi utilizzando una metodologia minimamente stressante. Queste particelle virali possono quindi essere utilizzate nei biotest delle gabbie delle api per testare la vitalità degli inoculi, nonché in varie altre dinamiche di infezione virale, comprese le interazioni con nutrizione, pesticidi e altri agenti patogeni. Uno dei principali vantaggi dell'utilizzo di tali particelle è che riduce notevolmente le possibilità di introdurre variabili sconosciute nella sperimentazione successiva rispetto alle alternative attuali, come l'infezione tramite emolinfa delle api infette o omogeneizzato, anche se è necessario prestare attenzione quando si acquistano le api, per ridurre al minimo la contaminazione da virus di fondo. I saggi in gabbia non sostituiscono esperimenti su larga scala e realistici sul campo che testano gli effetti dell'infezione virale a livello di colonia, ma funzionano invece come metodo per stabilire risposte virali di base che, in combinazione con le particelle virali semi-pure, possono servire come strumenti importanti per esaminare varie dimensioni delle interazioni fisiologiche ape-virus del miele.

Seguire con successo i protocolli (Figure 1) per l'iniezione pupale e l'estrazione virale dovrebbe produrre grandi quantità di particelle virali. Tuttavia, il campionamento e l'iniezione di pupe provenienti da una varietà di colonie in più punti temporali massimizza le possibilità di acquisire virus bersaglio con bassa contaminazione. La dinamica con cui i virus si replicano e interagiscono tra loro all'interno di un'ape mellifera non è ben compresa; accoppiato con la probabilità di infezione prees...

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Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera

Qui descriviamo due protocolli: in primo luogo per propagare, estrarre, purificare e quantificare grandi quantità di particelle virali non avvolte dalle api da miele, incluso un metodo per rimuovere le pupe delle api da miele e in secondo luogo per testare gli effetti dell'infezione virale utilizzando un biotest in gabbia altamente ripetibile e ad alto rendimento.

Preparazione dell'inoculo arricchito da virus per l'infezione orale delle api mellifere (Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees (Apis mellifera)

2.8K Views.  University of Illinois. Qui descriviamo due protocolli: in primo luogo per propagare, estrarre, purificare e quantificare grandi quantità di particelle virali non avvolte dalle api da miele, incluso un metodo per rimuovere le pupe delle api da miele e in secondo luogo per testare gli effetti dell'infezione virale utilizzando un biotest in gabbia altamente ripetibile e ad alto rendimento.

Video: Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera

Protocols for Oral Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be infected with polyhedra by droplet feeding and diet plug-based bioassays. This accompanying Springer Protocols section provides an overview of the baculovirus lifecycle and use of baculoviruses as insecticidal agents, including discussion of the pros and cons for use of baculoviruses as insecticides, and progress made in genetic enhancement of baculoviruses for improved insecticidal efficacy.

In this video, we demonstrate oral infection techniques of lepidopteran larvae with baculovirus in order to determine insecticidal efficiency.

Protocolli per infezione orale delle larve di lepidotteri con Baculovirus

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be ...

Ricerca

Biologia

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

The pancreatic acinar cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary role in the secretion of pancreatic enzymes into the pancreatic duct. It is also the site for the initiation of pancreatitis. Here we describe how acinar cells are isolated from whole pancreas tissue and intracellular calcium signals are measured. In addition, we describe the techniques of transfecting these cells with adenoviral constructs, and subsequently measuring the leakage of lactate dehydrogenase, a marker of cell injury, during conditions that induce acinar cell injury in vitro. These techniques provide a powerful tool to characterize acinar cell physiology and pathology.

We describe a reproducible method of preparing mouse pancreatic acinar cells from a mouse for the purpose of examining acinar cell calcium signals and cellular injury with physiologically and pathologically relevant stimuli. A method for adenoviral infection of these cells is also provided.

Preparazione delle cellule acinose pancreatiche per lo Scopo di Imaging di calcio, cellulari lesioni Misure e Infezione Adenoviral

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Methods for Comparing Nutrients in Beebread Made by Africanized and European Honey Bees and the Effects on Hemolymph Protein Titers

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees collect and convert to beebread by placing colonies in a specially constructed enclosed flight area. Methods were developed to analyze the protein and amino acid composition of the pollen and beebread. We also describe how consumption of the beebread was measured and methods used to determine adult worker bee hemolymph protein titers after feeding on beebread for 4, 7 and 11 days after emergence. Methods were applied to determine if genotype affects the conversion of pollen to beebread and the rate that bees consume and acquire protein from it. Two subspecies (European and Africanized honey bees; EHB and AHB respectively) were provided with the same pollen source. Based on the developed methods, beebread made by both subspecies had lower protein concentrations and pH values than the pollen. In general, amino acid concentrations in beebread made by either EHB or AHB were similar and occurred at higher levels in beebread than in pollen. Both AHB and EHB consumed significantly more of the beebread made by AHB than by EHB. Though EHB and AHB consumed similar amounts of each type of beebread, hemolymph protein concentrations in AHB were higher than in EHB. Differences in protein acquisition between AHB and EHB might reflect environmental adaptations related to the geographic region where each subspecies evolved. These differences could contribute to the successful establishment of AHB populations in the New World because of the effects on brood rearing and colony growth.

Here are methods to quantify nutrients in pollen before and after its conversion to beebread by two subspecies of honeybees. We describe techniques to measure beebread consumption and resulting protein titers in both subspecies.

Metodi per confrontare nutrienti in beebread Made by africanizzate e miele europeo api e gli effetti sulla I titoli emolinfa Protein

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees ...

Bone Conditioned Medium: Preparation and Bioassay

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing bone, they also support the complex process of bone regeneration. This favorable behavior of autografts is attributed to the three characteristics: osteoconductivity, osteogenicity, and osteoinductivity. However, there is another aspect: Bone grafts release a myriad of molecules, including growth factors, which can target mesenchymal cells involved in bone regeneration. The paracrine properties of bone grafts can be studied in vitro by the use of bone-conditioned medium (BCM). Here we present a protocol on how to prepare bone-conditioned medium from native pig cortical bone, and bone that underwent thermal processing or demineralization. Cells can be directly exposed to BCM or seeded onto biomaterials, such as collagen membranes, previously soaked with BCM. We give examples for in vitro bioassays with mesenchymal cells on the expression of TGF-&#946; regulated genes. The presented protocols should encourage to further reveal the paracrine effects of bone grafts during bone regeneration and open a path for translational research in the broad field of reconstructive surgery.

We describe here how to prepare bone-conditioned medium (BCM) and test its activity in vitro.

Bone mezzo condizionato: Preparazione e Bioassay

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing ...

Dissection and Observation of Honey Bee Dorsal Vessel for Studies of Cardiac Function

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination services, as well as an important model social insect used to study memory and learning, aging, and more. Here we describe a detailed protocol for the dissection of the dorsal abdominal wall of a bee in order to visualize its dorsal vessel, which serves the role of the heart in the insect. A successful dissection will expose a functional heart that, under the proper conditions, can maintain a steady heartbeat for an extended period of time. This allows the investigator to manipulate heart rate through the application of cardiomodulatory compounds to the dorsal vessel. By using either a digital microscope or a microscope equipped with a digital camera, the investigator can make video recordings of the dorsal vessel before and after treatment with test compounds. The videos can then be scored at a time convenient to the user in order to determine changes in heart rate, as well as changes in the pattern of heartbeats, following treatment. The advantages of this protocol are that it is relatively inexpensive to set up, easy to learn, requires little space or equipment, and takes very little time to conduct.

The abdominal dorsal vessel of the honey bee and other insects serves as the functional equivalent of the mammalian heart and plays an important role in nutrient transport, waste removal, immune function, and more. Here we describe a protocol for the visualization and pharmacological manipulation of bee heart rate.

Dissezione e di osservazione di Honey Bee dorsale della nave per gli studi della funzione cardiaca

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination ...

Monitoring Colony-level Effects of Sublethal Pesticide Exposure on Honey Bees

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment methods. Here we describe methods to measure the quantities of adult bees, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, by photographing frames, and by installing hives on scales and with internal sensors. Data from these periodic evaluations are then combined with running average and daily detrended data on hive weight and internal hive temperature. The resulting datasets have been used to detect colony-level effects of imidacloprid applied in a sugar syrup as low as 5 parts per billion. The methods are objective, require little training, and provide permanent records in the form of sensor output and photographs.

Sublethal doses of pesticides may affect colonies in ways that are difficult to detect using only periodic or visual methods. Methods to measure total adult bee mass, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, photographing frames, and installing sensors, are provided. Data analysis is also addressed.

Monitoraggio effetti Colonia-livello di esposizione dell'antiparassitario subletali sulle API di miele

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment ...

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how fluorescent recovery after photobleaching (FRAP) and photoactivation techniques can be used to study the spatiotemporal dynamics of proteins in subcellular locations. We also show how these techniques enable straightforward determination of various parameters linked to actin cytoskeletal regulation and cell motility. Moreover, the microinjection of cells is additionally described as an alternative treatment (potentially preceding or complementing the aforementioned photomanipulation techniques) to trigger instantaneous effects of translocated proteins on cell morphology and function. Micromanipulation such as protein injection or local application of plasma membrane-permeable drugs or cytoskeletal inhibitors can serve as powerful tool to record immediate consequences of a given treatment on cell behavior at the single cell and subcellular level. This is exemplified here by immediate induction of lamellipodial cell edge protrusion by the injection of recombinant Rac1 protein, as established a quarter-century ago. In addition, we provide a protocol for determining the turnover of enhanced green fluorescent protein (EGFP)-VASP, an actin filament polymerase prominently accumulating at lamellipodial tips of B16-F1 cells, employing FRAP and including associated data analysis and curve fitting. We also present guidelines for estimating the rates of lamellipodial actin network polymerization, as exemplified by cells expressing EGFP-tagged &#946;-actin. Finally, instructions are given for how to investigate the rates of actin monomer mobility within the cell cytoplasm, followed by actin incorporation at sites of rapid filament assembly, such as the tips of protruding lamellipodia, using photoactivation approaches. None of these protocols is&#160;restricted to components or regulators of the actin cytoskeleton, but can easily be extended to explore in analogous fashion the spatiotemporal dynamics and function of proteins in various different subcellular structures or functional contexts.

We describe how micro- and photomanipulation techniques such as FRAP and photoactivation enable the determination of motility parameters and the spatiotemporal dynamics of proteins within migrating cells. Experimental readouts include subcellular dynamics and turnover of motility regulators or of the underlying actin cytoskeleton.

Tecniche di micromanipolazione che consente analisi delle dinamiche morfogenetiche e fatturato dei regolatori del citoscheletro

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the best developed model systems of infection and innate immunity. While most work has focused on systemic infections, there has been a recent increase of interest in the mechanisms of gut immunocompetence to pathogens, which require methods to orally infect flies. Here we present a protocol to orally expose individual flies to an opportunistic bacterial pathogen (Pseudomonas aeruginosa) and a natural bacterial pathogen of D. melanogaster (Pseudomonas entomophila). The goal of this protocol is to provide a robust method to expose male and female flies to these pathogens. We provide representative results showing survival phenotypes, microbe loads, and bacterial shedding, which is relevant for the study of heterogeneity in pathogen transmission. Finally, we confirm that Dcy mutants (lacking the protective peritrophic matrix in the gut epithelium) and Relish mutants (lacking a functional immune deficiency (IMD) pathway), show increased susceptibility to bacterial oral infection. This protocol, therefore, describes a robust method to infect flies using the oral route of infection, which can be extended to the study of a variety genetic and environmental sources of variation in gut infection outcomes and bacterial transmission.

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

This protocol describes methods to orally expose and infect the fruit fly Drosophila melanogaster with bacterial pathogens, and to measure the number of infectious bacteria shed following gut infection. We further describe the effect of immune mutants on fly survival following oral bacterial infection.

Infezione batterica orale e spargimento in Drosophila melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the best developed model systems of infection and innate immunity. While most work has focused on systemic ...

Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not accurately capture the effects of agrochemical exposure on honey bee queens. As the sole producer of fertilized eggs inside a honeybee colony, the queen is arguably the most important single member of a functioning colony unit. Therefore, understanding how agrochemicals affect queen health and productivity should be considered a critical aspect of pesticide risk assessment. Here, an adapted method is presented to expose honey bee queens and worker queen attendants to agrochemical stressors administered through a worker diet, followed by tracking egg production in the laboratory and assessing first instar eclosion using a specialized cage, referred to as a Queen Monitoring Cage. To illustrate the method&#39;s intended use, results of an experiment in which worker queen attendants were fed diet containing sublethal doses of imidacloprid and effects on queens were monitored are described.

This protocol was developed to enhance the understanding of how agrochemicals affect honey bee (Apis mellifera) reproduction by establishing methods to expose honey bee queens and their worker caretakers to agrochemicals in a controlled, laboratory setting and carefully monitoring their relevant responses.

Valutazione del rischio agrochimico per le regine delle api da miele accoppiate

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward method to quickly identify the chemoattractants that could induce the chemotactic movement of rhizosphere growth-promoting bacteria on sterile glass slides via simple steps. Bacteria solution (OD600 = 0.5) and sterile chemoattractant aqueous solution were added dropwise on the glass slide at an interval of 1 cm. An inoculating loop was used to connect the chemoattractant aqueous solution to the bacterial solution. The slide was kept at room temperature for 20 min on the clean bench. Finally, the chemoattractant aqueous solution was collected for bacterial counting and microscopic observation. In this study, through multiple comparisons of experimental results, the method overcame multiple shortcomings of traditional bacterial chemotaxis methods. The method reduced the error of plate counting and shortened the experimental cycle. For the identification of chemoattractant substances, this new method can save 2-3 days compared to the traditional method. Additionally, this method allows any researcher to systematically complete a bacterial chemotaxis experiment within 1-2 days. The protocol can be considered a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Here, we present an improved chemotaxis assay protocol. The goal of this protocol is to reduce the steps and costs of traditional bacterial chemotaxis methods and to serve as a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Un test di chemiotassi migliorato per la rapida identificazione dei chemioattrattivi rizobatterici negli essudati radicali

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...