프로토콜 생성 과정에서 그녀의 아이디어와 토론에 대한 줄리아 파인 박사와 편집 전반에 걸쳐 도움이되는 의견을 주신 Cassondra Vernier 박사에게 감사드립니다. 이 자료들은 보조금 ID 549025에 따라 식량 농업 연구 재단이 부분적으로 지원하는 프로젝트에 기여했습니다.

저자는 공개 할 것이 없습니다.

여기에서는 유충 수집 및 바이러스 전파, 추출 및 농축뿐만 아니라 케이지 먹이 실험의 형태로 바이러스 처리를 포함하여 바이러스 증폭 및 접종 재고 준비 과정의 모든 단계를 자세히 설명하는 방법을 설명했습니다. 이러한 방법은 반순수 바이러스 입자의 생산을 허용하며(그림 4), 그 효과는 성인에게 치명적인 바이러스에 대한 용량-반응 사망률 테스트에 의해 일관되게 ?...

꿀벌 (Apis mellifera)은 현대 세계 농업 환경에서 중요한 역할을하지만 현재 살충제 노출, 가난한 사료, 기생충 및 병원균 1,2를 포함한 생물 학적 스트레스 요인과 비생물 적 스트레스 요인의 조합으로 고통 받고 있습니다. 우려되는 가장 중요한 병원균 중 하나는 바이러스이며, 그 중 많은 바이러스는 또 다른 주요 꿀벌 스트레스 요인 인 기생 Varroa 진드기 (Varroa 소멸자)에 의해 벡터화됩니다. 이 바이러스는 꿀벌에 일련의 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다 감소 된 새끼 생존, 발달 결함 및 마비를 포함하여 과동기 3,4,5 전후에 총 벌집 붕괴로 이어질 수 있습니다. 바이러스 감염 6,7,8,9 퇴치에 사용되는 기술 개발에는 유망한 발전이 있었지만, 꿀벌이나 식민지 내에서 많은 바이러스가 전파, 확산 및 상호 작용하는 역학은 여전히 잘 이해되지 않습니다 5,10 . 꿀벌과 바이러스 상호 작용의 기본 생물학과 다른 환경 요인과의 관계를 이해하는 것은 효과적인 바이러스 관리 기술을 개발하는 데 중요합니다.
그러나 꿀벌 - 바이러스 상호 작용을 연구하는 것은 과정을 복잡하게 만드는 수많은 알려진 요인과 알려지지 않은 요인으로 인해 어려움을 겪습니다. 여기에는 식이요법 11,12, 살충제 노출(13), 꿀벌 유전적 배경(14,15)과의 상호작용이 포함된다. 바이러스 감염에만 초점을 맞출 때조차도, 꿀벌 개체군은 관리되고 야생이기 때문에 합병증이 흔합니다.하지만 종종 급성 증상을 나타내지 않고 바이러스 16,17 및바이러스 공동 감염의 효과는 잘 이해되지 않습니다 18. 이로 인해 꿀벌 바이러스 효과에 대한 연구가 풀리기 어려워졌습니다.
많은 꿀벌 바이러스 연구는 상황 바이러스 감염을 사용하여 다른 스트레스 요인과의 상호 작용을 찾아 배경 감염이 다른 치료법12,19,20,21과 어떻게 변하는지 관찰했습니다. 이 접근법은 중요한 효과, 특히 살충제 또는식이 요법이 바이러스 수준과 복제에 어떻게 영향을 미치는지 발견하는 데 성공했지만 알려진 함량과 농도의 바이러스 처리 접종은 바이러스 감염 역학의 실험적 테스트에 중요합니다. 그럼에도 불구하고 실험적 치료를 배경 감염과 분리하는 것도 어려움을 초래할 수 있습니다. 현장 연구에서 연구자들은 꿀벌에서 꿀벌22로 바이러스가 전염되는 증거를 제공하기 위해 변형 된 날개 바이러스 (DWV)의 균주를 차별화했지만이 접근법을 사용하는 것은 꿀벌만으로는 어려울 것입니다. 바이러스 감염성 클론은 감염 23,24,25을 추적하는 것뿐만 아니라 꿀벌 바이러스의 역 유전학 연구 및 바이러스 - 숙주 상호 작용 연구 26,27,28을위한 강력한 도구입니다. 그러나 대부분의 경우, 감염성 클론은 입자를 생산하기 위해 세포 내부의 감염주기를 충족시켜야합니다. 이러한 입자는 그들의 감염성이 네이키드 바이러스 RNA보다 높고 캡슐화된 게놈을 사용한 접종이 자연 감염을 모방하기 때문에 실험적 치료를 위한 접종물로서 바람직하다.
오염되지 않은 순수 꿀벌 바이러스 접종물 (야생형 바이러스 균주 또는 감염성 클론에서 유래 한 균주)의 생산은 또한 도전을 제기합니다. 이들은 주로 순수 균주 바이러스29,30을 생산하기 위해 신뢰할 수 있고, 지속적으로 복제되는, 바이러스가 없는 꿀벌 세포주를 수득하는데 어려움 때문이다. 일부 세포주가 생산되었지만, 이러한 시스템은 불완전한 상태로 남아 있습니다. 그럼에도 불구하고 생존 가능한 세포주가29 개 생산되어 바이러스 생산 및 조사를보다 세밀하게 제어 할 수 있기를 희망합니다. 이러한 라인이 널리 이용가능해질 때까지, 대부분의 바이러스 생산 프로토콜은 생체내 바이러스 생산 및 정제(18,31,32,33,34)의 사용에 계속 의존할 것이다. 이러한 접근법에는 관심있는 바이러스 입자를 확인하고 정화 (또는 전염성 클론을 생산)하고이를 사용하여 꿀벌, 보통 번데기와 같은 꿀벌을 감염시키는 것이 포함됩니다. 번데기는 표적 바이러스와 함께 주입 된 다음 희생되고 더 많은 입자가 추출되고 정제됩니다. 그러나 처음에는 바이러스가없는 꿀벌이 없기 때문에 그러한 농축액에서 다른 바이러스의 흔적으로 인해 어느 정도 오염이 항상 발생하므로 배경 감염 가능성이 낮은 꿀벌을 선택할 때 세심한주의를 기울여야합니다. 또한, 이들 프로토콜(33)에 사용하기 위해 빗 세포로부터 번데기를 제거하는 방법은 매우 노동 집약적이며 꿀벌에서 스트레스를 유도할 수 있으며, 이러한 수단(18,32)에 의해 생산을 제한한다. 여기에서, 우리는 꿀벌에 대한 노동이 거의없고 기계적 스트레스가 적고 애벌레를 대규모로 제거 할 수있는 대체 방법을보고합니다.
번데기를 얻고 시작 바이러스 접종물과 함께 주입하면 바이러스가 복제 할 시간을 제공하기 위해 배양되어야합니다. 이어서, 생산된 바이러스 입자는 실험용 꿀벌을 감염시키는 데 사용할 수 있는 형태로 가공될 수 있다. 이를 달성하기 위한 몇 가지 간단한 방법들이 있는데, 여기에는 바이러스적으로 감염된 꿀벌로부터 생성된 조질 균질액(35,36) 또는 용혈림프(37)를 감염원으로서 사용하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 효과적이지만 배경 기질로부터 알려지지 않은 변수 (예 : 죽은 벌 균질물의 다른 요인)를 도입 할 가능성이 더 큽니다. 또한, 실험이 단기간에 바이러스의 크고 알려진 복용량을 제공해야하는 경우 입자를 집중시키는 것이 바람직합니다. 따라서, 보다 나은 제어를 위해, 바이러스 입자의 어느 정도의 정제 및 농축을 허용하는 방법을 사용하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 일련의 침전 및 원심분리 단계는 거의 모든 가능한 비표적 바이러스 물질(33)의 제거를 초래할 것이다.
이 농축 접종물을 생산 한 후, 바이러스 역가 (qPCR)를 정량화하고 생체 내 생물 분석법으로 특성화하여 생존력과 사망률을 유발하는 능력을 테스트 할뿐만 아니라 감염 후 증가 된 바이러스 역가가 얻어진다는 것을 확증하는 것이 유익합니다. 이것은 주사 실험 (번데기 또는 성인으로) 또는 먹이 실험 (애벌레 또는 성인에게)을 통해 달성 될 수 있습니다. 이러한 모든 접근법이 가능하지만 새장에있는 성인 꿀벌 그룹에 먹이를주는 것이 종종 가장 빠르고 간단합니다. 케이지 분석 방법은 또한 살충제 독성38, 난소 발달39 및 행동40,41에 대한 영양 영향을 포함하여 꿀벌에 대한 다양한 다른 치료법을 테스트하는 데 널리 사용되므로 바이러스 감염과 다른 요인(42)을 연결하는 실험을위한 좋은 기초를 형성 할 수 있습니다.
여기서는 꿀벌에 대한 노동 및 기계적 스트레스를 줄이는 번데기를 제거하는 방법과 바이러스 감염 및 효과를 테스트하기위한 반복성이 높고 처리량이 높은 생물 분석을 포함하여 값 비싼 초원심분리기를 사용하지 않고 대량의 반 순수하고 고농축 바이러스 입자를 생산하는 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. 바이러스 접종의 순도를 엄격하게 조절함으로써 조사관은 다른 바이러스 접종 방법에 비해 꿀벌 바이러스 반응의 변화를 줄일 수 있습니다. 또한, 생물 분석은 현장 현실적인 설정으로 확장하기 전에 매우 반복 가능한 실험 단위를 사용하여 소그룹 수준에서 바이러스 효과를 스크리닝 할 수 있으며, 이는 관리하기에 훨씬 더 노동 집약적입니다. 이 두 가지 방법이 결합되어 꿀벌 - 바이러스 생리 학적 상호 작용에 대한 전반적인 이해를 향상시키는 데 도움이되는 연구에 필요한 도구를 제공합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% bleach solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24:1 chloroform:isoamyl alcohol</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>C0549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cages for bioassay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dependent on experimental setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitips Advanced 0.1 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089405</td>
			<td>Optional (if no injector appartus is available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Containers for larval self-removal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Should measure roughly 19&#34; x 9-1/8&#34; (Langstroth deep frame dimensions)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of maintaining 34 &#186;C and 50% relative humidity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>Any absorbent wipe will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium-sized weight boats</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Serve as inoculum trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcon-100kDa with Biomax membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>MPE100025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>P5119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 8000 (PEG)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>1546605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of 15,000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of 21,000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater M4 Multipipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000322</td>
			<td>Optional (if no injector appartus is available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7000TS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse-free water</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>T1375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of virus-enriched inoculum for oral infection of honey bees (apis mellifera)

꿀벌은 전 세계적으로 생태 학적 및 농업적으로 매우 중요하지만 바이러스 성 병원균에 노출되는 것을 포함하여 꿀벌 건강에 부정적인 영향을 미치는 다양한 압력을받습니다. 이러한 바이러스는 매우 다양한 파괴적인 효과를 일으킬 수 있으며 실험 치료의 효과를 기존의 배경 감염과 분리하는 것을 어렵게 만드는 여러 요인으로 인해 연구하기가 어려울 수 있습니다. 여기서 우리는 바이러스 감염 및 효과를 테스트하기 위해 높은 처리량의 생물 분석과 함께 다량의 바이러스 입자를 대량 생산하는 방법을 제시합니다. 현재 바이러스가없는 지속적인 꿀벌 세포주의 부족으로 인해 바이러스 입자는 최소한의 스트레스 방법론을 사용하여 벌집에서 대량으로 추출되는 꿀벌 번데기를 사용하여 생체 내에서 증폭됩니다. 이 바이러스 입자는 꿀벌 케이지 생물 검정에 사용되어 접종 생존력뿐만 아니라 영양, 살충제 및 기타 병원체와의 상호 작용을 포함한 다양한 다른 바이러스 감염 역학을 테스트 할 수 있습니다. 이러한 입자를 사용하는 가장 큰 장점은 감염된 꿀벌 용혈림프 또는 균질화에 의한 감염과 같은 현재의 대안과 비교할 때 후속 실험에서 알려지지 않은 변수를 도입 할 가능성을 크게 줄여 주지만 꿀벌을 소싱 할 때는주의를 기울여야하지만 배경 바이러스 오염을 최소화해야한다는 것입니다. 케이지 분석은 콜로니 수준에서 바이러스 감염 효과를 테스트하는 대규모 현장 현실적인 실험을 대체하는 것이 아니라 반순수 바이러스 입자와 결합하여 꿀벌과 바이러스 생리 적 상호 작용의 다양한 차원을 검사하는 중요한 도구 역할을 할 수있는 기준선 바이러스 반응을 확립하는 방법으로 기능합니다.

번데기 주사 및 바이러스 추출을위한 프로토콜 (그림 1)을 성공적으로 따르면 다량의 바이러스 입자가 생성되어야합니다. 그러나 여러 시점에서 다양한 콜로니에서 공급되는 번데기를 샘플링하고 주입하면 오염이 적은 표적 바이러스를 획득 할 가능성이 극대화됩니다. 꿀벌 내에서 바이러스가 복제되고 서로 상호 작용하는 역학은 잘 이해되지 않았습니다. 기존 감염의 가능성과 함?...

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Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera

여기서 우리는 두 가지 프로토콜을 설명합니다 : 먼저 꿀벌 번데기를 제거하는 방법을 포함하여 다량의 꿀벌 비 외피 바이러스 입자를 전파, 추출, 정제 및 정량화하는 것과 두 번째로 반복성이 높고 처리량이 높은 케이지 생물 검정을 사용하여 바이러스 감염의 효과를 테스트하는 것입니다.

꿀벌의 구강 감염을위한 바이러스 풍부 접종물 준비 (Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee ...

preparation-virus-enriched-inoculum-for-oral-infection-honey-bees

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees (Apis mellifera)

2.8K 조회수.  University of Illinois. 여기서 우리는 두 가지 프로토콜을 설명합니다 : 먼저 꿀벌 번데기를 제거하는 방법을 포함하여 다량의 꿀벌 비 외피 바이러스 입자를 전파, 추출, 정제 및 정량화하는 것과 두 번째로 반복성이 높고 처리량이 높은 케이지 생물 검정을 사용하여 바이러스 감염의 효과를 테스트하는 것입니다.

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Protocols for Oral Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be infected with polyhedra by droplet feeding and diet plug-based bioassays. This accompanying Springer Protocols section provides an overview of the baculovirus lifecycle and use of baculoviruses as insecticidal agents, including discussion of the pros and cons for use of baculoviruses as insecticides, and progress made in genetic enhancement of baculoviruses for improved insecticidal efficacy.

In this video, we demonstrate oral infection techniques of lepidopteran larvae with baculovirus in order to determine insecticidal efficiency.

Baculovirus과 Lepidopteran 애벌레의 구강 감염 프로토콜

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be ...

연구

생물학

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

The pancreatic acinar cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary role in the secretion of pancreatic enzymes into the pancreatic duct. It is also the site for the initiation of pancreatitis. Here we describe how acinar cells are isolated from whole pancreas tissue and intracellular calcium signals are measured. In addition, we describe the techniques of transfecting these cells with adenoviral constructs, and subsequently measuring the leakage of lactate dehydrogenase, a marker of cell injury, during conditions that induce acinar cell injury in vitro. These techniques provide a powerful tool to characterize acinar cell physiology and pathology.

We describe a reproducible method of preparing mouse pancreatic acinar cells from a mouse for the purpose of examining acinar cell calcium signals and cellular injury with physiologically and pathologically relevant stimuli. A method for adenoviral infection of these cells is also provided.

칼슘 이미징의 목적, 세포 상해 측정 및 아데노 바이러스 감염 췌장 포상 세포의 준비

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Methods for Comparing Nutrients in Beebread Made by Africanized and European Honey Bees and the Effects on Hemolymph Protein Titers

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees collect and convert to beebread by placing colonies in a specially constructed enclosed flight area. Methods were developed to analyze the protein and amino acid composition of the pollen and beebread. We also describe how consumption of the beebread was measured and methods used to determine adult worker bee hemolymph protein titers after feeding on beebread for 4, 7 and 11 days after emergence. Methods were applied to determine if genotype affects the conversion of pollen to beebread and the rate that bees consume and acquire protein from it. Two subspecies (European and Africanized honey bees; EHB and AHB respectively) were provided with the same pollen source. Based on the developed methods, beebread made by both subspecies had lower protein concentrations and pH values than the pollen. In general, amino acid concentrations in beebread made by either EHB or AHB were similar and occurred at higher levels in beebread than in pollen. Both AHB and EHB consumed significantly more of the beebread made by AHB than by EHB. Though EHB and AHB consumed similar amounts of each type of beebread, hemolymph protein concentrations in AHB were higher than in EHB. Differences in protein acquisition between AHB and EHB might reflect environmental adaptations related to the geographic region where each subspecies evolved. These differences could contribute to the successful establishment of AHB populations in the New World because of the effects on brood rearing and colony growth.

Here are methods to quantify nutrients in pollen before and after its conversion to beebread by two subspecies of honeybees. We describe techniques to measure beebread consumption and resulting protein titers in both subspecies.

아프리칸 유럽 꿀 꿀벌에 의해 만들어 Beebread의 영양소를 비교하는 방법과하는 Hemolymph 단백질 역가에 미치는 영향

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees ...

Bone Conditioned Medium: Preparation and Bioassay

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing bone, they also support the complex process of bone regeneration. This favorable behavior of autografts is attributed to the three characteristics: osteoconductivity, osteogenicity, and osteoinductivity. However, there is another aspect: Bone grafts release a myriad of molecules, including growth factors, which can target mesenchymal cells involved in bone regeneration. The paracrine properties of bone grafts can be studied in vitro by the use of bone-conditioned medium (BCM). Here we present a protocol on how to prepare bone-conditioned medium from native pig cortical bone, and bone that underwent thermal processing or demineralization. Cells can be directly exposed to BCM or seeded onto biomaterials, such as collagen membranes, previously soaked with BCM. We give examples for in vitro bioassays with mesenchymal cells on the expression of TGF-&#946; regulated genes. The presented protocols should encourage to further reveal the paracrine effects of bone grafts during bone regeneration and open a path for translational research in the broad field of reconstructive surgery.

We describe here how to prepare bone-conditioned medium (BCM) and test its activity in vitro.

뼈 조정 배지 : 준비 및 생물 검정

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing ...

Dissection and Observation of Honey Bee Dorsal Vessel for Studies of Cardiac Function

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination services, as well as an important model social insect used to study memory and learning, aging, and more. Here we describe a detailed protocol for the dissection of the dorsal abdominal wall of a bee in order to visualize its dorsal vessel, which serves the role of the heart in the insect. A successful dissection will expose a functional heart that, under the proper conditions, can maintain a steady heartbeat for an extended period of time. This allows the investigator to manipulate heart rate through the application of cardiomodulatory compounds to the dorsal vessel. By using either a digital microscope or a microscope equipped with a digital camera, the investigator can make video recordings of the dorsal vessel before and after treatment with test compounds. The videos can then be scored at a time convenient to the user in order to determine changes in heart rate, as well as changes in the pattern of heartbeats, following treatment. The advantages of this protocol are that it is relatively inexpensive to set up, easy to learn, requires little space or equipment, and takes very little time to conduct.

The abdominal dorsal vessel of the honey bee and other insects serves as the functional equivalent of the mammalian heart and plays an important role in nutrient transport, waste removal, immune function, and more. Here we describe a protocol for the visualization and pharmacological manipulation of bee heart rate.

심장 기능의 연구에 대한 해부와 벌 꿀 지느러미 선박의 관측

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination ...

Monitoring Colony-level Effects of Sublethal Pesticide Exposure on Honey Bees

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment methods. Here we describe methods to measure the quantities of adult bees, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, by photographing frames, and by installing hives on scales and with internal sensors. Data from these periodic evaluations are then combined with running average and daily detrended data on hive weight and internal hive temperature. The resulting datasets have been used to detect colony-level effects of imidacloprid applied in a sugar syrup as low as 5 parts per billion. The methods are objective, require little training, and provide permanent records in the form of sensor output and photographs.

Sublethal doses of pesticides may affect colonies in ways that are difficult to detect using only periodic or visual methods. Methods to measure total adult bee mass, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, photographing frames, and installing sensors, are provided. Data analysis is also addressed.

꿀 꿀벌에 Sublethal 농약 노출의 식민지 수준 효과 모니터링

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment ...

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how fluorescent recovery after photobleaching (FRAP) and photoactivation techniques can be used to study the spatiotemporal dynamics of proteins in subcellular locations. We also show how these techniques enable straightforward determination of various parameters linked to actin cytoskeletal regulation and cell motility. Moreover, the microinjection of cells is additionally described as an alternative treatment (potentially preceding or complementing the aforementioned photomanipulation techniques) to trigger instantaneous effects of translocated proteins on cell morphology and function. Micromanipulation such as protein injection or local application of plasma membrane-permeable drugs or cytoskeletal inhibitors can serve as powerful tool to record immediate consequences of a given treatment on cell behavior at the single cell and subcellular level. This is exemplified here by immediate induction of lamellipodial cell edge protrusion by the injection of recombinant Rac1 protein, as established a quarter-century ago. In addition, we provide a protocol for determining the turnover of enhanced green fluorescent protein (EGFP)-VASP, an actin filament polymerase prominently accumulating at lamellipodial tips of B16-F1 cells, employing FRAP and including associated data analysis and curve fitting. We also present guidelines for estimating the rates of lamellipodial actin network polymerization, as exemplified by cells expressing EGFP-tagged &#946;-actin. Finally, instructions are given for how to investigate the rates of actin monomer mobility within the cell cytoplasm, followed by actin incorporation at sites of rapid filament assembly, such as the tips of protruding lamellipodia, using photoactivation approaches. None of these protocols is&#160;restricted to components or regulators of the actin cytoskeleton, but can easily be extended to explore in analogous fashion the spatiotemporal dynamics and function of proteins in various different subcellular structures or functional contexts.

We describe how micro- and photomanipulation techniques such as FRAP and photoactivation enable the determination of motility parameters and the spatiotemporal dynamics of proteins within migrating cells. Experimental readouts include subcellular dynamics and turnover of motility regulators or of the underlying actin cytoskeleton.

Micromanipulation 기법 전체적 역동성의 분석 및 Cytoskeletal 레 귤 레이 터의

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the best developed model systems of infection and innate immunity. While most work has focused on systemic infections, there has been a recent increase of interest in the mechanisms of gut immunocompetence to pathogens, which require methods to orally infect flies. Here we present a protocol to orally expose individual flies to an opportunistic bacterial pathogen (Pseudomonas aeruginosa) and a natural bacterial pathogen of D. melanogaster (Pseudomonas entomophila). The goal of this protocol is to provide a robust method to expose male and female flies to these pathogens. We provide representative results showing survival phenotypes, microbe loads, and bacterial shedding, which is relevant for the study of heterogeneity in pathogen transmission. Finally, we confirm that Dcy mutants (lacking the protective peritrophic matrix in the gut epithelium) and Relish mutants (lacking a functional immune deficiency (IMD) pathway), show increased susceptibility to bacterial oral infection. This protocol, therefore, describes a robust method to infect flies using the oral route of infection, which can be extended to the study of a variety genetic and environmental sources of variation in gut infection outcomes and bacterial transmission.

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

This protocol describes methods to orally expose and infect the fruit fly Drosophila melanogaster with bacterial pathogens, and to measure the number of infectious bacteria shed following gut infection. We further describe the effect of immune mutants on fly survival following oral bacterial infection.

세균성 감염 및 Shedding 초파리 melanogaster 에

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the best developed model systems of infection and innate immunity. While most work has focused on systemic ...

Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not accurately capture the effects of agrochemical exposure on honey bee queens. As the sole producer of fertilized eggs inside a honeybee colony, the queen is arguably the most important single member of a functioning colony unit. Therefore, understanding how agrochemicals affect queen health and productivity should be considered a critical aspect of pesticide risk assessment. Here, an adapted method is presented to expose honey bee queens and worker queen attendants to agrochemical stressors administered through a worker diet, followed by tracking egg production in the laboratory and assessing first instar eclosion using a specialized cage, referred to as a Queen Monitoring Cage. To illustrate the method&#39;s intended use, results of an experiment in which worker queen attendants were fed diet containing sublethal doses of imidacloprid and effects on queens were monitored are described.

This protocol was developed to enhance the understanding of how agrochemicals affect honey bee (Apis mellifera) reproduction by establishing methods to expose honey bee queens and their worker caretakers to agrochemicals in a controlled, laboratory setting and carefully monitoring their relevant responses.

꿀벌 여왕을 짝짓기하는 농약적 위험 평가

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward method to quickly identify the chemoattractants that could induce the chemotactic movement of rhizosphere growth-promoting bacteria on sterile glass slides via simple steps. Bacteria solution (OD600 = 0.5) and sterile chemoattractant aqueous solution were added dropwise on the glass slide at an interval of 1 cm. An inoculating loop was used to connect the chemoattractant aqueous solution to the bacterial solution. The slide was kept at room temperature for 20 min on the clean bench. Finally, the chemoattractant aqueous solution was collected for bacterial counting and microscopic observation. In this study, through multiple comparisons of experimental results, the method overcame multiple shortcomings of traditional bacterial chemotaxis methods. The method reduced the error of plate counting and shortened the experimental cycle. For the identification of chemoattractant substances, this new method can save 2-3 days compared to the traditional method. Additionally, this method allows any researcher to systematically complete a bacterial chemotaxis experiment within 1-2 days. The protocol can be considered a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Here, we present an improved chemotaxis assay protocol. The goal of this protocol is to reduce the steps and costs of traditional bacterial chemotaxis methods and to serve as a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

루트 엑수데이트에서 뿌리 균 화학 물질의 신속 한 식별에 대 한 향상 된 화학 분석

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...