Wir möchten Dr. Julia Fine für ihre Ideen und Diskussionen während des Protokollerstellungsprozesses sowie Dr. Cassondra Vernier für ihre hilfreichen Kommentare während der Bearbeitung danken. Diese Materialien trugen zu Projekten bei, die zum Teil von der Foundation for Food and Agriculture Research unter der Förderkennung 549025 unterstützt wurden.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Hier haben wir Methoden beschrieben, die jeden Schritt der Virusamplifikation und des Impfbestandsvorbereitungsprozesses detailliert beschreiben, einschließlich der Larvensammlung und Virusvermehrung, -extraktion und -konzentration sowie der Virusbehandlung in Form von Käfigfütterungsexperimenten. Diese Methoden ermöglichen die Herstellung von halbreinen Viruspartikeln (Abbildung 4), deren Wirksamkeit durch Dosis-Wirkungs-Mortalitätstests für Viren, die für Erwachsene tödlich sind, k...

Honigbienen (Apis mellifera) spielen eine entscheidende Rolle in der modernen globalen Agrarlandschaft, leiden aber derzeit unter einer Kombination aus biotischen und abiotischen Stressfaktoren, einschließlich Pestizidbelastung, schlechtem Futter, Parasiten und Krankheitserregern 1,2. Einer der wichtigsten Krankheitserreger sind Viren, von denen viele von einem anderen der wichtigsten Honigbienenstressoren, der parasitären Varroa-Milbe (Varroa destructor), übertragen werden. Diese Viren können eine Reihe von negativen Auswirkungen bei Honigbienen verursachen, darunter ein vermindertes Brutüberleben, Entwicklungsdefekte und Lähmungen, die sowohl vor als auch nach Überwinterungsperioden zu einem totalen Bienenstockkollaps führenkönnen 3,4,5. Obwohl es vielversprechende Fortschritte bei der Entwicklung von Technologien zur Bekämpfung von Virusinfektionen gegeben hat 6,7,8,9, ist die Dynamik, durch die sich viele Viren innerhalb einer Honigbiene oder eines Honigvolkes ausbreiten, verbreiten und interagieren, immer noch wenig verstanden 5,10 . Das Verständnis der grundlegenden Biologie von Honigbienen- und Virusinteraktionen und ihrer Beziehungen zu anderen Umweltfaktoren ist entscheidend für die Entwicklung effektiver Virusmanagementtechniken.
Die Untersuchung von Honigbienen-Virus-Interaktionen stellt jedoch eine Herausforderung dar, da zahlreiche bekannte und unbekannte Faktoren den Prozess erschweren. Dazu gehören Wechselwirkungen mit der Ernährung 11,12, die Pestizidbelastung 13 und der genetische Hintergrundder Bienen 14,15. Selbst wenn man sich nur auf die Virusinfektion konzentriert, sind Komplikationen häufig, da Honigbienenpopulationen, sowohl verwaltete als auch wilde, immer ein gewisses Maß an Hintergrundvirusinfektion aufweisen, wenn auch oft ohne akute Symptome zu manifestieren16,17, und die Auswirkungen der Viruskoinfektion sind nicht gut verstanden 18. Dies hat es schwierig gemacht, die Auswirkungen des Honigbienenvirus zu entwirren.
Viele Honigbienenvirusstudien haben Indizienvirusinfektionen verwendet, um nach Wechselwirkungen mit anderen Stressfaktoren zu suchen und zu beobachten, wie sich Hintergrundinfektionen mit anderen Behandlungenändern 12,19,20,21. Während dieser Ansatz erfolgreich bei der Identifizierung wichtiger Effekte war, insbesondere bei der Entdeckung, wie sich Pestizide oder diätetische Behandlungen auf das Virusniveau und die Replikation auswirken, ist die Inokulation mit einer Virusbehandlung mit bekanntem Inhalt und bekannter Konzentration entscheidend für experimentelle Tests der Virusinfektionsdynamik. Dennoch kann die Trennung der experimentellen Behandlung von der Hintergrundinfektion auch Herausforderungen mit sich bringen. In Feldstudien haben Forscher Stämme des deformierten Flügelvirus (DWV) differenziert, um Beweise für die Virusübertragung von Honigbienen auf Hummeln22 zu liefern, aber die Verwendung dieses Ansatzes wäre bei Honigbienen allein schwierig. Virusinfektiöse Klone sind ein leistungsfähiges Werkzeug, nicht nur für die Verfolgung von Infektionen 23,24,25, sondern auch für umgekehrte genetische Studien von Honigbienenviren und für die Virus-Wirt-Interaktionsforschung26,27,28. In den meisten Fällen sind jedoch immer noch infektiöse Klone erforderlich, um den Infektionszyklus in Zellen zu erfüllen, um Partikel zu produzieren. Solche Partikel werden als Impfmittel für experimentelle Behandlungen bevorzugt, da ihre Infektiosität höher ist als die nackte virale RNA und die Impfung mit verkapselten Genomen eine natürliche Infektion nachahmt.
Die Produktion von reinen, nicht kontaminierten Honigbienenvirus-Inokula (Wildtyp-Virusstämme oder solche, die von infektiösen Klonen stammen) stellt ebenfalls eine Herausforderung dar. Diese sind in erster Linie auf die Schwierigkeiten zurückzuführen, eine zuverlässige, kontinuierlich replizierende, virusfreie Honigbienenzelllinie zur Herstellung von Reinstammviren zu erhalten29,30. Während einige Zelllinien produziert wurden, bleiben diese Systeme unvollkommen; Dennoch besteht die Hoffnung, dass eine lebensfähige Zelllinie produziert werdenkann 29, die eine feinere Kontrolle der Virusproduktion und -untersuchung ermöglichen würde. Bis eine solche Linie allgemein verfügbar ist, werden die meisten Virenproduktionsprotokolle weiterhin auf die Verwendung von In-vivo-Virusproduktion und -reinigung angewiesen sein 18,31,32,33,34. Diese Ansätze beinhalten die Identifizierung und Reinigung von Viruspartikeln von Interesse (oder die Herstellung eines infektiösen Klons) und deren Verwendung zur Infektion von Honigbienen, normalerweise als Puppen. Die Puppen werden mit dem Zielvirus injiziert und dann geopfert, und weitere Partikel werden extrahiert und gereinigt. Da jedoch keine Bienen von vornherein virenfrei sind, gibt es immer ein gewisses Maß an Kontamination durch Spuren anderer Viren in einem solchen Konzentrat, und daher muss bei der Auswahl von Bienen mit einer geringen Wahrscheinlichkeit von Hintergrundinfektionen große Sorgfalt angewendet werden. Darüber hinaus sind Methoden zur Entfernung der Puppen aus den Kammzellen zur Verwendung in diesen Protokollen 33 sehr arbeitsintensiv und können Stress bei den Bienen auslösen, wodurch die Produktion auf diese Weise begrenztwird 18,32. Hier berichten wir über eine alternative Methode, die eine großflächige Entfernung von Larven mit wenig Arbeit und weniger mechanischer Belastung der Bienen ermöglicht.
Sobald Puppen erhalten und mit dem Startvirus-Inokulum injiziert wurden, müssen sie inkubiert werden, um dem Virus Zeit zu geben, sich zu replizieren. Anschließend können produzierte Viruspartikel zu einer Form verarbeitet werden, die zur Infektion experimenteller Bienen verwendet werden kann. Es gibt mehrere einfache Methoden, um dies zu erreichen, einschließlich der Verwendung eines rohen Homogenats 35,36 oder Hämolymph, das von viral infizierten Bienen als Infektionsquelle erzeugtwird 37. Diese Methoden sind effektiv, haben aber eine größere Chance, unbekannte Variablen aus dem Hintergrundsubstrat einzuführen (z. B. andere Faktoren in den toten Bienenhomogenaten). Darüber hinaus ist es wünschenswert, die Partikel zu konzentrieren, wenn ein Experiment eine große, bekannte Dosis eines Virus in kurzer Zeit erfordert. Daher ist es für eine bessere Kontrolle vorzuziehen, Methoden zu verwenden, die ein gewisses Maß an Reinigung und Konzentration der Viruspartikel ermöglichen. Im Allgemeinen führt eine Reihe von Fällungs- und Zentrifugationsschritten zur Entfernung fast aller möglichen Nichtzielvirenmaterialien33.
Nach der Herstellung dieses konzentrierten Inokulums ist es vorteilhaft, die viralen Titer (qPCR) zu quantifizieren und mit In-vivo-Bioassays zu charakterisieren, um ihre Lebensfähigkeit und Fähigkeit, Mortalität zu verursachen, zu testen und zu bestätigen, dass nach der Infektion erhöhte Virustiter erhalten werden. Dies kann durch Injektionsexperimente (entweder in Puppen oder Erwachsene) oder Fütterungsexperimente (in Larven oder Erwachsene) erreicht werden. Während all diese Ansätze möglich sind, ist die Fütterung von Gruppen erwachsener Bienen in einem Käfig oft die schnellste und einfachste. Die Käfiguntersuchungsmethode wird auch häufig zum Testen verschiedener anderer Behandlungen an Bienen verwendet, einschließlich Pestizidtoxizität38, Eierstockentwicklung39 und Ernährungseinfluss auf das Verhalten 40,41 und kann daher eine gute Grundlage für Experimente bilden, die eine Virusinfektion mit anderen Faktorenverbinden 42.
Hier beschreiben wir eine zuverlässige Methode zur Herstellung großer Mengen halbreiner, hochangereicherter Viruspartikel ohne Verwendung einer teuren Ultrazentrifuge, einschließlich einer Methode zur Entfernung von Puppen, die den Arbeitsaufwand und die mechanische Belastung der Bienen reduziert, und eines hochgradig wiederholbaren Hochdurchsatz-Bioassays zum Testen von Virusinfektionen und -wirkungen. Durch die strenge Kontrolle der Reinheit der viralen Impfung sind die Forscher in der Lage, die Variation der Virusreaktion von Honigbienen im Vergleich zu anderen viralen Impfmethoden zu reduzieren. Darüber hinaus kann der Bioassay auf der Ebene kleiner Gruppen mit hochgradig wiederholbaren experimentellen Einheiten nach viralen Effekten suchen, bevor er auf feldrealistische Einstellungen skaliert wird, was weitaus arbeitsintensiver zu handhaben ist. In Kombination bieten diese beiden Methoden die notwendigen Werkzeuge für Studien, die dazu beitragen können, unser allgemeines Verständnis der physiologischen Wechselwirkungen zwischen Honigbiene und -Virus zu verbessern.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% bleach solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24:1 chloroform:isoamyl alcohol</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>C0549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cages for bioassay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dependent on experimental setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitips Advanced 0.1 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089405</td>
			<td>Optional (if no injector appartus is available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Containers for larval self-removal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Should measure roughly 19&#34; x 9-1/8&#34; (Langstroth deep frame dimensions)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of maintaining 34 &#186;C and 50% relative humidity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>Any absorbent wipe will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium-sized weight boats</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Serve as inoculum trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcon-100kDa with Biomax membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>MPE100025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>P5119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 8000 (PEG)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>1546605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of 15,000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of 21,000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater M4 Multipipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000322</td>
			<td>Optional (if no injector appartus is available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7000TS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse-free water</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>T1375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of virus-enriched inoculum for oral infection of honey bees (apis mellifera)

Honigbienen sind weltweit von großer ökologischer und landwirtschaftlicher Bedeutung, unterliegen aber auch einer Vielzahl von Belastungen, die sich negativ auf die Bienengesundheit auswirken, einschließlich der Exposition gegenüber viralen Krankheitserregern. Solche Viren können eine Vielzahl von verheerenden Auswirkungen verursachen und können aufgrund mehrerer Faktoren, die es schwierig machen, die Auswirkungen experimenteller Behandlungen von einer bereits bestehenden Hintergrundinfektion zu trennen, oft schwierig zu untersuchen sein. Hier stellen wir eine Methode zur Massenproduktion großer Mengen von Viruspartikeln zusammen mit einem Hochdurchsatz-Bioassay vor, um Virusinfektionen und -effekte zu testen. Aufgrund des derzeitigen Fehlens einer kontinuierlichen, virusfreien Honigbienenzelllinie werden die Viruspartikel in vivo mit Honigbienenpuppen verstärkt, die mit einer minimal-stressigen Methodik in großen Mengen aus dem Bienenstock extrahiert werden. Diese Viruspartikel können dann in Bioassays für Honigbienenkäfige verwendet werden, um die Inokula-Lebensfähigkeit sowie verschiedene andere Virusinfektionsdynamiken zu testen, einschließlich Wechselwirkungen mit Ernährung, Pestiziden und anderen Krankheitserregern. Ein großer Vorteil der Verwendung solcher Partikel besteht darin, dass die Wahrscheinlichkeit, unbekannte Variablen in nachfolgende Experimente einzuführen, im Vergleich zu aktuellen Alternativen, wie z. B. einer Infektion über infizierte Bienenhämolymphe oder Homogenat, erheblich verringert wird, obwohl bei der Beschaffung der Bienen immer noch darauf geachtet werden sollte, die Kontamination mit Hintergrundviren zu minimieren. Die Käfigassays sind kein Ersatz für groß angelegte, feldrealistische Experimente, die die Auswirkungen von Virusinfektionen auf Kolonieebene testen, sondern dienen stattdessen als Methode zur Etablierung grundlegender viraler Reaktionen, die in Kombination mit den halbreinen Viruspartikeln als wichtige Werkzeuge zur Untersuchung verschiedener Dimensionen der physiologischen Wechselwirkungen zwischen Honigbiene und -Virus dienen können.

Die erfolgreiche Befolgung der Protokolle (Abbildungen 1) für die Puppeninjektion und die Virusextraktion sollte große Mengen an Viruspartikeln erzeugen. Die Probenahme und Injektion von Puppen, die zu mehreren Zeitpunkten aus einer Vielzahl von Kolonien stammen, maximiert jedoch die Chancen, Zielviren mit geringer Kontamination zu erwerben. Die Dynamik, durch die sich Viren innerhalb einer Honigbiene replizieren und miteinander interagieren, ist nicht gut verstanden; In Verbindung mit der Wahrscheinli...

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Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera

Hier beschreiben wir zwei Protokolle: Erstens, um große Mengen von nicht umhüllten Viruspartikeln der Honigbiene zu vermehren, zu extrahieren, zu reinigen und zu quantifizieren, einschließlich einer Methode zur Entfernung von Honigbienenpuppen, und zweitens, um die Auswirkungen einer Virusinfektion mit einem hochgradig wiederholbaren Käfigbioassay mit hohem Durchsatz zu testen.

Herstellung von virusangereichertem Inokulum zur oralen Infektion von Honigbienen (Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee ...

preparation-virus-enriched-inoculum-for-oral-infection-honey-bees

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees (Apis mellifera)

2.8K Aufrufe.  University of Illinois. Hier beschreiben wir zwei Protokolle: Erstens, um große Mengen von nicht umhüllten Viruspartikeln der Honigbiene zu vermehren, zu extrahieren, zu reinigen und zu quantifizieren, einschließlich einer Methode zur Entfernung von Honigbienenpuppen, und zweitens, um die Auswirkungen einer Virusinfektion mit einem hochgradig wiederholbaren Käfigbioassay mit hohem Durchsatz zu testen.

Serie: Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera

Protocols for Oral Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be infected with polyhedra by droplet feeding and diet plug-based bioassays. This accompanying Springer Protocols section provides an overview of the baculovirus lifecycle and use of baculoviruses as insecticidal agents, including discussion of the pros and cons for use of baculoviruses as insecticides, and progress made in genetic enhancement of baculoviruses for improved insecticidal efficacy.

In this video, we demonstrate oral infection techniques of lepidopteran larvae with baculovirus in order to determine insecticidal efficiency.

Protokolle für orale Infektion von Schmetterlingslarven mit Baculovirus

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be ...

Forschung

Biologie

Extraction of the EPP Component from the Surface EMG

A surface electromyogram (EMG), especially when recorded near the neuromuscular junction, is expected to contain the endplate potential (EPP) component which can be extracted with an appropriate signal filter. Two factors are important: the EMG must be recorded in monopolar fashion, and the recording must be done so the low frequency signal corresponding the EPP is not eliminated. This report explains how to extract the EPP component from the EMG of the masseter muscle in a human subject. The surface EMG is recorded from eight sites using traditional disc electrodes aligned along over the muscle, with equal inter-electrode distance from the zygomatic arch to the angle of mandible in response to quick gum clenching. A reference electrode is placed on the tip of the nose. The EPP component is extracted from the raw EMGs by applying a high-cut digital filter (2nd dimension Butterworth filter) with a range of 10-35 Hz. When the filter is set to 10 Hz, the extracted EPP wave deflects either negative or positive depending on the recording site. The difference in the polarity reflects the sink-source relation of the end plate current, with the site showing the most negative deflection corresponding to the neuromuscular junction. In the case of the masseter muscle, the neuromuscular junction is estimated to be located in the inferior portion close to the angle of mandible. The EPP component exhibits an interesting oscillation when the cut-off frequency of the high-cut digital filter is set to 30 Hz. The EPP oscillation indicates that muscle contraction is adjusted in an intermittent manner. Abnormal tremors accompanying various sorts of diseases may be substantially due to this EPP oscillation, which becomes slower and is difficult to cease.

The endplate potential (EPP) component can be extracted from the surface EMG using a digital filter. The extracted EPP shows oscillation with a frequency of about 30 Hz.

Extraction der EVP-Komponente aus dem Oberflächen-EMG

A surface electromyogram (EMG), especially when recorded near the neuromuscular junction, is expected to contain the endplate potential (EPP) component ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

Ableitung der Maus Trophoblast Stammzellen aus Blastozysten

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

The pancreatic acinar cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary role in the secretion of pancreatic enzymes into the pancreatic duct. It is also the site for the initiation of pancreatitis. Here we describe how acinar cells are isolated from whole pancreas tissue and intracellular calcium signals are measured. In addition, we describe the techniques of transfecting these cells with adenoviral constructs, and subsequently measuring the leakage of lactate dehydrogenase, a marker of cell injury, during conditions that induce acinar cell injury in vitro. These techniques provide a powerful tool to characterize acinar cell physiology and pathology.

We describe a reproducible method of preparing mouse pancreatic acinar cells from a mouse for the purpose of examining acinar cell calcium signals and cellular injury with physiologically and pathologically relevant stimuli. A method for adenoviral infection of these cells is also provided.

Herstellung von Azinuszellen des Pankreas für die Zwecke von Calcium Imaging, Cell Verletzung Messungen und Adenovirus-Infektion

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Methods for Comparing Nutrients in Beebread Made by Africanized and European Honey Bees and the Effects on Hemolymph Protein Titers

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees collect and convert to beebread by placing colonies in a specially constructed enclosed flight area. Methods were developed to analyze the protein and amino acid composition of the pollen and beebread. We also describe how consumption of the beebread was measured and methods used to determine adult worker bee hemolymph protein titers after feeding on beebread for 4, 7 and 11 days after emergence. Methods were applied to determine if genotype affects the conversion of pollen to beebread and the rate that bees consume and acquire protein from it. Two subspecies (European and Africanized honey bees; EHB and AHB respectively) were provided with the same pollen source. Based on the developed methods, beebread made by both subspecies had lower protein concentrations and pH values than the pollen. In general, amino acid concentrations in beebread made by either EHB or AHB were similar and occurred at higher levels in beebread than in pollen. Both AHB and EHB consumed significantly more of the beebread made by AHB than by EHB. Though EHB and AHB consumed similar amounts of each type of beebread, hemolymph protein concentrations in AHB were higher than in EHB. Differences in protein acquisition between AHB and EHB might reflect environmental adaptations related to the geographic region where each subspecies evolved. These differences could contribute to the successful establishment of AHB populations in the New World because of the effects on brood rearing and colony growth.

Here are methods to quantify nutrients in pollen before and after its conversion to beebread by two subspecies of honeybees. We describe techniques to measure beebread consumption and resulting protein titers in both subspecies.

Methoden zum Vergleich der Nährstoffe in Bienenbrot Hergestellt von Africanized und europäischen Honigbienen und die Auswirkungen auf die Hämolymphe Protein Titer

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees ...

Bone Conditioned Medium: Preparation and Bioassay

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing bone, they also support the complex process of bone regeneration. This favorable behavior of autografts is attributed to the three characteristics: osteoconductivity, osteogenicity, and osteoinductivity. However, there is another aspect: Bone grafts release a myriad of molecules, including growth factors, which can target mesenchymal cells involved in bone regeneration. The paracrine properties of bone grafts can be studied in vitro by the use of bone-conditioned medium (BCM). Here we present a protocol on how to prepare bone-conditioned medium from native pig cortical bone, and bone that underwent thermal processing or demineralization. Cells can be directly exposed to BCM or seeded onto biomaterials, such as collagen membranes, previously soaked with BCM. We give examples for in vitro bioassays with mesenchymal cells on the expression of TGF-&#946; regulated genes. The presented protocols should encourage to further reveal the paracrine effects of bone grafts during bone regeneration and open a path for translational research in the broad field of reconstructive surgery.

We describe here how to prepare bone-conditioned medium (BCM) and test its activity in vitro.

Knochen konditioniertem Medium: Vorbereitung und Bioassay

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing ...

Dissection and Observation of Honey Bee Dorsal Vessel for Studies of Cardiac Function

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination services, as well as an important model social insect used to study memory and learning, aging, and more. Here we describe a detailed protocol for the dissection of the dorsal abdominal wall of a bee in order to visualize its dorsal vessel, which serves the role of the heart in the insect. A successful dissection will expose a functional heart that, under the proper conditions, can maintain a steady heartbeat for an extended period of time. This allows the investigator to manipulate heart rate through the application of cardiomodulatory compounds to the dorsal vessel. By using either a digital microscope or a microscope equipped with a digital camera, the investigator can make video recordings of the dorsal vessel before and after treatment with test compounds. The videos can then be scored at a time convenient to the user in order to determine changes in heart rate, as well as changes in the pattern of heartbeats, following treatment. The advantages of this protocol are that it is relatively inexpensive to set up, easy to learn, requires little space or equipment, and takes very little time to conduct.

The abdominal dorsal vessel of the honey bee and other insects serves as the functional equivalent of the mammalian heart and plays an important role in nutrient transport, waste removal, immune function, and more. Here we describe a protocol for the visualization and pharmacological manipulation of bee heart rate.

Dissection und Beobachtung von Honey Bee Dorsal Schiff für Untersuchungen der Herzfunktion

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination ...

Monitoring Colony-level Effects of Sublethal Pesticide Exposure on Honey Bees

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment methods. Here we describe methods to measure the quantities of adult bees, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, by photographing frames, and by installing hives on scales and with internal sensors. Data from these periodic evaluations are then combined with running average and daily detrended data on hive weight and internal hive temperature. The resulting datasets have been used to detect colony-level effects of imidacloprid applied in a sugar syrup as low as 5 parts per billion. The methods are objective, require little training, and provide permanent records in the form of sensor output and photographs.

Sublethal doses of pesticides may affect colonies in ways that are difficult to detect using only periodic or visual methods. Methods to measure total adult bee mass, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, photographing frames, and installing sensors, are provided. Data analysis is also addressed.

Überwachung der Kolonie-Ebene Auswirkungen der subletalen Schädlingsbekämpfungsmittelbelichtung auf Honigbienen

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment ...

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how fluorescent recovery after photobleaching (FRAP) and photoactivation techniques can be used to study the spatiotemporal dynamics of proteins in subcellular locations. We also show how these techniques enable straightforward determination of various parameters linked to actin cytoskeletal regulation and cell motility. Moreover, the microinjection of cells is additionally described as an alternative treatment (potentially preceding or complementing the aforementioned photomanipulation techniques) to trigger instantaneous effects of translocated proteins on cell morphology and function. Micromanipulation such as protein injection or local application of plasma membrane-permeable drugs or cytoskeletal inhibitors can serve as powerful tool to record immediate consequences of a given treatment on cell behavior at the single cell and subcellular level. This is exemplified here by immediate induction of lamellipodial cell edge protrusion by the injection of recombinant Rac1 protein, as established a quarter-century ago. In addition, we provide a protocol for determining the turnover of enhanced green fluorescent protein (EGFP)-VASP, an actin filament polymerase prominently accumulating at lamellipodial tips of B16-F1 cells, employing FRAP and including associated data analysis and curve fitting. We also present guidelines for estimating the rates of lamellipodial actin network polymerization, as exemplified by cells expressing EGFP-tagged &#946;-actin. Finally, instructions are given for how to investigate the rates of actin monomer mobility within the cell cytoplasm, followed by actin incorporation at sites of rapid filament assembly, such as the tips of protruding lamellipodia, using photoactivation approaches. None of these protocols is&#160;restricted to components or regulators of the actin cytoskeleton, but can easily be extended to explore in analogous fashion the spatiotemporal dynamics and function of proteins in various different subcellular structures or functional contexts.

We describe how micro- and photomanipulation techniques such as FRAP and photoactivation enable the determination of motility parameters and the spatiotemporal dynamics of proteins within migrating cells. Experimental readouts include subcellular dynamics and turnover of motility regulators or of the underlying actin cytoskeleton.

Mikromanipulation Techniken Analyse der morphogenetischen Dynamik und Umsatz des Zytoskeletts Regulatoren

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the best developed model systems of infection and innate immunity. While most work has focused on systemic infections, there has been a recent increase of interest in the mechanisms of gut immunocompetence to pathogens, which require methods to orally infect flies. Here we present a protocol to orally expose individual flies to an opportunistic bacterial pathogen (Pseudomonas aeruginosa) and a natural bacterial pathogen of D. melanogaster (Pseudomonas entomophila). The goal of this protocol is to provide a robust method to expose male and female flies to these pathogens. We provide representative results showing survival phenotypes, microbe loads, and bacterial shedding, which is relevant for the study of heterogeneity in pathogen transmission. Finally, we confirm that Dcy mutants (lacking the protective peritrophic matrix in the gut epithelium) and Relish mutants (lacking a functional immune deficiency (IMD) pathway), show increased susceptibility to bacterial oral infection. This protocol, therefore, describes a robust method to infect flies using the oral route of infection, which can be extended to the study of a variety genetic and environmental sources of variation in gut infection outcomes and bacterial transmission.

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

This protocol describes methods to orally expose and infect the fruit fly Drosophila melanogaster with bacterial pathogens, and to measure the number of infectious bacteria shed following gut infection. We further describe the effect of immune mutants on fly survival following oral bacterial infection.

Mündliche bakterielle Infektion und Shedding in Drosophila melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the best developed model systems of infection and innate immunity. While most work has focused on systemic ...