Wir möchten Dr. Julia Fine für ihre Ideen und Diskussionen während des Protokollerstellungsprozesses sowie Dr. Cassondra Vernier für ihre hilfreichen Kommentare während der Bearbeitung danken. Diese Materialien trugen zu Projekten bei, die zum Teil von der Foundation for Food and Agriculture Research unter der Förderkennung 549025 unterstützt wurden.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Hier haben wir Methoden beschrieben, die jeden Schritt der Virusamplifikation und des Impfbestandsvorbereitungsprozesses detailliert beschreiben, einschließlich der Larvensammlung und Virusvermehrung, -extraktion und -konzentration sowie der Virusbehandlung in Form von Käfigfütterungsexperimenten. Diese Methoden ermöglichen die Herstellung von halbreinen Viruspartikeln (Abbildung 4), deren Wirksamkeit durch Dosis-Wirkungs-Mortalitätstests für Viren, die für Erwachsene tödlich sind, konsistent quantifiziert werden kann (Abbildung 5). Nach Bestätigung der Infektionsfähigkeit und/oder Pathologie können die erzeugten Partikel dann in Bioassays verwendet werden, um die Wechselwirkungen zwischen Honigbienen und Honigbienenviren aufzuklären.
Einer der wichtigsten Vorteile der beschriebenen Protokolle besteht darin, dass jedes Protokoll leicht auf ein großes Volumen skaliert werden kann, unabhängig davon, ob es sich um Puppenernte, produzierte Partikel oder durchgeführte Bioassays handelt. Mit den Puppenexzisionsmethoden33 kann man erwarten, ~ 100 Puppen pro Stunde zu entfernen, obwohl diese Zahl mit der Kompetenz skaliert. Die hier beschriebene Methode der Larvenselbstentfernung erfordert zwar unterschiedliche Planungs- und Terminierungsverfahren, kann jedoch leicht das 10- bis 20-fache dieser Anzahl entfernter Bienen über Nacht erzeugen, während sie vergleichsweise wenig manuellen Aufwand und weniger mechanische Belastung für die Bienen erfordert.
Die Haupteinschränkung dieser Methode besteht darin, dass es keine Möglichkeit gibt, zu garantieren, dass die selbst entfernten Larven nicht zuvor Varroa-befallen waren. Regelmäßige Milbenbehandlung und Überwachung von Quell-Nesselsucht kann dieses Risiko minimieren, aber einige Larven haben möglicherweise immer noch ein gewisses Maß an Varroa-Parasitisierung gehabt. Das manuelle Entfernen von Puppen einzeln ermöglicht es dem Benutzer jedoch, zu beobachten, ob Milben in der Zelle einer bestimmten Puppe vorhanden sind. Da der Selbstentfernungsprozess auf dem Nahrungssuchverhalten der Larven beruht, müssen die Rahmen, die diese Larven enthalten, vor der endgültigen Fütterung, die normalerweise stattfindet, entfernt werden. Nur aufgrund dieser mangelnden Versorgung durch die Arbeiter kriechen die Larven aus ihren Zellen. Daher erfahren die aus dieser Methode abgeleiteten Puppen ein sehr kurzes Fenster des Ernährungsstresses im Vergleich zu Larven, die sich vollständig in einer Kolonie entwickelt haben und etwas kleiner erscheinen können. Dies ist besonders bemerkenswert bei den jüngsten Larven in der Kohorte, die auf dem Rahmen vorhanden ist; Da die Königin Eier über ein 24-Stunden-Fenster gelegt hat, fehlt diesen Larven proportional mehr Fütterungszeit. Diese sind während der Verpuppung in der Regel deutlich auffällig für ihre sehr geringe Größe im Vergleich zu denen, die durch manuelle Exzision entfernt wurden. Das Volumen der Larven, die durch Selbstentfernung produziert werden, gleicht jedoch ihre verminderte individuelle Biomasse mehr als aus. Darüber hinaus kann die manuelle Exzisionsmethode auch eine erhebliche mechanische Belastung der Puppen verursachen, wenn sie aus ihren Zellen gezogen werden. Wenn eine der beiden Methoden als Teil eines Experiments und nicht nur zur Herstellung von Viruspartikeln verwendet werden soll, sollte darauf geachtet werden, dass angemessene Kontrollen sichergestellt werden.
Unabhängig von der Extraktionsmethode kann das Virusvermehrungsprotokoll große Mengen an Viruspartikeln mit den Puppen erzeugen, was die Variabilität minimiert, die durch andere derzeit praktizierte Virusimpfmethoden induziertwird 35,36,37 beim Testen auf die virale Reaktion von Honigbienen. Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Protokoll mit nicht behüllten Viren in der Reihenfolge Picornavirales (z. B. israelisches akutes Lähmungsvirus, deformiertes Flügelvirus) optimiert und getestet wurde. Bei der Arbeit mit behüllten Viren sollten verschiedene Strategien zur Isolierung viraler Partikel befolgt werden44. Als grobe Näherung wurde jede der 16 Proben, die an der Virusernte beteiligt waren (einschließlich der 4 Kolonien in Abbildung 4), aus 200-300 injizierten Puppen erzeugt und ergab zwischen 2-2,5 ml konzentrierte Viruspartikelpräparate. Unter der Annahme einer Virus-Inokulum-Konzentration von 0,1% und eines Standard-35-Bienenkäfigs würde jedes der 16 Viruspräparate genügend Partikel für 3.300-4.200 Käfige liefern. Dieser Überschuss an infektiösem Material reduziert experimentelle Einschränkungen und ermöglicht Bioassays mit hohem Durchsatz. Es ist wichtig zu beachten, dass, obwohl das Viruspartikelkonzentrat bei einer Lagerung bei -80 ° C monate- oder jahrelang lebensfähig bleiben kann, die Infektiosität langsam abnehmen kann, selbst wenn es wenigen Frost-Tau-Zyklen ausgesetzt ist. Es wird daher empfohlen, den viralen Präparatstock in kleinen Aliquots zu lagern, von denen einige dann verwendet werden können, um virale Titer zu quantifizieren und die Behandlungsdosis zum Zeitpunkt des Experiments zu überprüfen. Darüber hinaus verstärkt die in Abbildung 5 gezeigte Variabilität zwischen den Jahren die Notwendigkeit regelmäßiger Dosis-Wirkungs-Tests, wodurch die Wahrscheinlichkeit eines unerwarteten Verlusts der Viruslebensfähigkeit minimiert wird.
Die Käfig-Bioassays selbst haben ebenfalls Einschränkungen oder zumindest Vorbehalte, die berücksichtigt werden müssen, wobei die primäre die künstliche Natur der Käfig-Bioassay-Umgebung ist (Abbildung 3). Die Gruppierung von Bienen in Gehegen ermöglicht virale Tests über die individuelle Ebene hinaus; Der Käfig wird zur Versuchseinheit und nicht zur Biene selbst. Obwohl dies einer tatsächlichen Kolonie ähnlicher ist als einer einzelnen Biene, die isoliert behandelt wird, ist es immer noch weit von einer realistischen Bienenstockumgebung entfernt. Entfernt von der sozialen Umgebung, einschließlich Königinnen- und Brutpheromonen, Bienen unterschiedlichen Alters und anderen Hinweisen, reagieren diese Bienen möglicherweise nicht so wie eine Kolonie in voller Größe. Dies sind jedoch in erster Linie Überlegungen für größere Experimente mit dem Käfigsystem. Die Ergebnisse von viralen Käfig-Bioassays sollten in erster Linie als Basisinformationseinrichtung behandelt werden, die verwendet werden kann, um zukünftige Virustestentscheidungen zu informieren, die nach Wunsch des Benutzers auf eine feldrealistischere Einstellung skaliert werden.
Die hier beschriebenen Methoden bieten ein standardisiertes Verfahren zur Massenproduktion von Viruspartikeln für den Einsatz in Honigbienen-Virusassays. Solche Assays wurden bereits implementiert, um verschiedene Aspekte der Wechselwirkungen zwischen Honigbiene und Virus zu untersuchen, einschließlich Multi-Virus-Infektionen und wie sich die Ernährungsqualität und Nahrungsergänzungsmittel auf das Überleben angesichts einer Virusinfektionauswirken 11,18,45,46. Sie wurden für den Einsatz in kolonieweiten Infektionsexperimenten11,47 und zur Untersuchung der Auswirkungen von Infektionen auf das Verhalten 47 und die Genexpression 48 skaliert. Insgesamt bieten diese Methoden eine Grundlage für Werkzeuge, die zur Herstellung und Bewertung von Honigbienenvirus-Inokula verwendet werden können.

Honigbienen (Apis mellifera) spielen eine entscheidende Rolle in der modernen globalen Agrarlandschaft, leiden aber derzeit unter einer Kombination aus biotischen und abiotischen Stressfaktoren, einschließlich Pestizidbelastung, schlechtem Futter, Parasiten und Krankheitserregern 1,2. Einer der wichtigsten Krankheitserreger sind Viren, von denen viele von einem anderen der wichtigsten Honigbienenstressoren, der parasitären Varroa-Milbe (Varroa destructor), übertragen werden. Diese Viren können eine Reihe von negativen Auswirkungen bei Honigbienen verursachen, darunter ein vermindertes Brutüberleben, Entwicklungsdefekte und Lähmungen, die sowohl vor als auch nach Überwinterungsperioden zu einem totalen Bienenstockkollaps führenkönnen 3,4,5. Obwohl es vielversprechende Fortschritte bei der Entwicklung von Technologien zur Bekämpfung von Virusinfektionen gegeben hat 6,7,8,9, ist die Dynamik, durch die sich viele Viren innerhalb einer Honigbiene oder eines Honigvolkes ausbreiten, verbreiten und interagieren, immer noch wenig verstanden 5,10 . Das Verständnis der grundlegenden Biologie von Honigbienen- und Virusinteraktionen und ihrer Beziehungen zu anderen Umweltfaktoren ist entscheidend für die Entwicklung effektiver Virusmanagementtechniken.
Die Untersuchung von Honigbienen-Virus-Interaktionen stellt jedoch eine Herausforderung dar, da zahlreiche bekannte und unbekannte Faktoren den Prozess erschweren. Dazu gehören Wechselwirkungen mit der Ernährung 11,12, die Pestizidbelastung 13 und der genetische Hintergrundder Bienen 14,15. Selbst wenn man sich nur auf die Virusinfektion konzentriert, sind Komplikationen häufig, da Honigbienenpopulationen, sowohl verwaltete als auch wilde, immer ein gewisses Maß an Hintergrundvirusinfektion aufweisen, wenn auch oft ohne akute Symptome zu manifestieren16,17, und die Auswirkungen der Viruskoinfektion sind nicht gut verstanden 18. Dies hat es schwierig gemacht, die Auswirkungen des Honigbienenvirus zu entwirren.
Viele Honigbienenvirusstudien haben Indizienvirusinfektionen verwendet, um nach Wechselwirkungen mit anderen Stressfaktoren zu suchen und zu beobachten, wie sich Hintergrundinfektionen mit anderen Behandlungenändern 12,19,20,21. Während dieser Ansatz erfolgreich bei der Identifizierung wichtiger Effekte war, insbesondere bei der Entdeckung, wie sich Pestizide oder diätetische Behandlungen auf das Virusniveau und die Replikation auswirken, ist die Inokulation mit einer Virusbehandlung mit bekanntem Inhalt und bekannter Konzentration entscheidend für experimentelle Tests der Virusinfektionsdynamik. Dennoch kann die Trennung der experimentellen Behandlung von der Hintergrundinfektion auch Herausforderungen mit sich bringen. In Feldstudien haben Forscher Stämme des deformierten Flügelvirus (DWV) differenziert, um Beweise für die Virusübertragung von Honigbienen auf Hummeln22 zu liefern, aber die Verwendung dieses Ansatzes wäre bei Honigbienen allein schwierig. Virusinfektiöse Klone sind ein leistungsfähiges Werkzeug, nicht nur für die Verfolgung von Infektionen 23,24,25, sondern auch für umgekehrte genetische Studien von Honigbienenviren und für die Virus-Wirt-Interaktionsforschung26,27,28. In den meisten Fällen sind jedoch immer noch infektiöse Klone erforderlich, um den Infektionszyklus in Zellen zu erfüllen, um Partikel zu produzieren. Solche Partikel werden als Impfmittel für experimentelle Behandlungen bevorzugt, da ihre Infektiosität höher ist als die nackte virale RNA und die Impfung mit verkapselten Genomen eine natürliche Infektion nachahmt.
Die Produktion von reinen, nicht kontaminierten Honigbienenvirus-Inokula (Wildtyp-Virusstämme oder solche, die von infektiösen Klonen stammen) stellt ebenfalls eine Herausforderung dar. Diese sind in erster Linie auf die Schwierigkeiten zurückzuführen, eine zuverlässige, kontinuierlich replizierende, virusfreie Honigbienenzelllinie zur Herstellung von Reinstammviren zu erhalten29,30. Während einige Zelllinien produziert wurden, bleiben diese Systeme unvollkommen; Dennoch besteht die Hoffnung, dass eine lebensfähige Zelllinie produziert werdenkann 29, die eine feinere Kontrolle der Virusproduktion und -untersuchung ermöglichen würde. Bis eine solche Linie allgemein verfügbar ist, werden die meisten Virenproduktionsprotokolle weiterhin auf die Verwendung von In-vivo-Virusproduktion und -reinigung angewiesen sein 18,31,32,33,34. Diese Ansätze beinhalten die Identifizierung und Reinigung von Viruspartikeln von Interesse (oder die Herstellung eines infektiösen Klons) und deren Verwendung zur Infektion von Honigbienen, normalerweise als Puppen. Die Puppen werden mit dem Zielvirus injiziert und dann geopfert, und weitere Partikel werden extrahiert und gereinigt. Da jedoch keine Bienen von vornherein virenfrei sind, gibt es immer ein gewisses Maß an Kontamination durch Spuren anderer Viren in einem solchen Konzentrat, und daher muss bei der Auswahl von Bienen mit einer geringen Wahrscheinlichkeit von Hintergrundinfektionen große Sorgfalt angewendet werden. Darüber hinaus sind Methoden zur Entfernung der Puppen aus den Kammzellen zur Verwendung in diesen Protokollen 33 sehr arbeitsintensiv und können Stress bei den Bienen auslösen, wodurch die Produktion auf diese Weise begrenztwird 18,32. Hier berichten wir über eine alternative Methode, die eine großflächige Entfernung von Larven mit wenig Arbeit und weniger mechanischer Belastung der Bienen ermöglicht.
Sobald Puppen erhalten und mit dem Startvirus-Inokulum injiziert wurden, müssen sie inkubiert werden, um dem Virus Zeit zu geben, sich zu replizieren. Anschließend können produzierte Viruspartikel zu einer Form verarbeitet werden, die zur Infektion experimenteller Bienen verwendet werden kann. Es gibt mehrere einfache Methoden, um dies zu erreichen, einschließlich der Verwendung eines rohen Homogenats 35,36 oder Hämolymph, das von viral infizierten Bienen als Infektionsquelle erzeugtwird 37. Diese Methoden sind effektiv, haben aber eine größere Chance, unbekannte Variablen aus dem Hintergrundsubstrat einzuführen (z. B. andere Faktoren in den toten Bienenhomogenaten). Darüber hinaus ist es wünschenswert, die Partikel zu konzentrieren, wenn ein Experiment eine große, bekannte Dosis eines Virus in kurzer Zeit erfordert. Daher ist es für eine bessere Kontrolle vorzuziehen, Methoden zu verwenden, die ein gewisses Maß an Reinigung und Konzentration der Viruspartikel ermöglichen. Im Allgemeinen führt eine Reihe von Fällungs- und Zentrifugationsschritten zur Entfernung fast aller möglichen Nichtzielvirenmaterialien33.
Nach der Herstellung dieses konzentrierten Inokulums ist es vorteilhaft, die viralen Titer (qPCR) zu quantifizieren und mit In-vivo-Bioassays zu charakterisieren, um ihre Lebensfähigkeit und Fähigkeit, Mortalität zu verursachen, zu testen und zu bestätigen, dass nach der Infektion erhöhte Virustiter erhalten werden. Dies kann durch Injektionsexperimente (entweder in Puppen oder Erwachsene) oder Fütterungsexperimente (in Larven oder Erwachsene) erreicht werden. Während all diese Ansätze möglich sind, ist die Fütterung von Gruppen erwachsener Bienen in einem Käfig oft die schnellste und einfachste. Die Käfiguntersuchungsmethode wird auch häufig zum Testen verschiedener anderer Behandlungen an Bienen verwendet, einschließlich Pestizidtoxizität38, Eierstockentwicklung39 und Ernährungseinfluss auf das Verhalten 40,41 und kann daher eine gute Grundlage für Experimente bilden, die eine Virusinfektion mit anderen Faktorenverbinden 42.
Hier beschreiben wir eine zuverlässige Methode zur Herstellung großer Mengen halbreiner, hochangereicherter Viruspartikel ohne Verwendung einer teuren Ultrazentrifuge, einschließlich einer Methode zur Entfernung von Puppen, die den Arbeitsaufwand und die mechanische Belastung der Bienen reduziert, und eines hochgradig wiederholbaren Hochdurchsatz-Bioassays zum Testen von Virusinfektionen und -wirkungen. Durch die strenge Kontrolle der Reinheit der viralen Impfung sind die Forscher in der Lage, die Variation der Virusreaktion von Honigbienen im Vergleich zu anderen viralen Impfmethoden zu reduzieren. Darüber hinaus kann der Bioassay auf der Ebene kleiner Gruppen mit hochgradig wiederholbaren experimentellen Einheiten nach viralen Effekten suchen, bevor er auf feldrealistische Einstellungen skaliert wird, was weitaus arbeitsintensiver zu handhaben ist. In Kombination bieten diese beiden Methoden die notwendigen Werkzeuge für Studien, die dazu beitragen können, unser allgemeines Verständnis der physiologischen Wechselwirkungen zwischen Honigbiene und -Virus zu verbessern.

<table><tbody><tr><td>10% bleach solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24:1 chloroform:isoamyl alcohol</td><td>SigmaAldrich</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>70% ethanol solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cages for bioassay</td><td></td><td></td><td>Dependent on experimental setup</td></tr><tr><td>Combitips Advanced 0.1 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30089405</td><td>Optional (if no injector appartus is available)</td></tr><tr><td>Containers for larval self-removal</td><td></td><td></td><td>Should measure roughly 19&quot; x 9-1/8&quot; (Langstroth deep frame dimensions)</td></tr><tr><td>Forceps</td><td></td><td></td><td>Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision</td></tr><tr><td>Fume hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td></td><td></td><td>Capable of maintaining 34 &amp;ordm;C and 50% relative humidity</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td>Any absorbent wipe will work</td></tr><tr><td>Medium-sized weight boats</td><td></td><td></td><td>Serve as inoculum trays</td></tr><tr><td>Microcon-100kDa with Biomax membrane</td><td>MilliporeSigma</td><td>MPE100025</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrile gloves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>SigmaAldrich</td><td>P5119</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene glycol 8000 (PEG)</td><td>SigmaAldrich</td><td>1546605</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated benchtop centrifuge</td><td></td><td></td><td>Capable of 15,000 x g</td></tr><tr><td>Refrigerated centrifuge</td><td></td><td></td><td>Capable of 21,000 x g</td></tr><tr><td>Repeater M4 Multipipette</td><td>Eppendorf</td><td>4982000322</td><td>Optional (if no injector appartus is available)</td></tr><tr><td>RNAse Away</td><td>ThermoFisher</td><td>7000TS1</td><td></td></tr><tr><td>RNAse-free water</td><td>SigmaAldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TES</td><td>SigmaAldrich</td><td>T1375</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of virus-enriched inoculum for oral infection of honey bees (apis mellifera)

Honigbienen sind weltweit von großer ökologischer und landwirtschaftlicher Bedeutung, unterliegen aber auch einer Vielzahl von Belastungen, die sich negativ auf die Bienengesundheit auswirken, einschließlich der Exposition gegenüber viralen Krankheitserregern. Solche Viren können eine Vielzahl von verheerenden Auswirkungen verursachen und können aufgrund mehrerer Faktoren, die es schwierig machen, die Auswirkungen experimenteller Behandlungen von einer bereits bestehenden Hintergrundinfektion zu trennen, oft schwierig zu untersuchen sein. Hier stellen wir eine Methode zur Massenproduktion großer Mengen von Viruspartikeln zusammen mit einem Hochdurchsatz-Bioassay vor, um Virusinfektionen und -effekte zu testen. Aufgrund des derzeitigen Fehlens einer kontinuierlichen, virusfreien Honigbienenzelllinie werden die Viruspartikel in vivo mit Honigbienenpuppen verstärkt, die mit einer minimal-stressigen Methodik in großen Mengen aus dem Bienenstock extrahiert werden. Diese Viruspartikel können dann in Bioassays für Honigbienenkäfige verwendet werden, um die Inokula-Lebensfähigkeit sowie verschiedene andere Virusinfektionsdynamiken zu testen, einschließlich Wechselwirkungen mit Ernährung, Pestiziden und anderen Krankheitserregern. Ein großer Vorteil der Verwendung solcher Partikel besteht darin, dass die Wahrscheinlichkeit, unbekannte Variablen in nachfolgende Experimente einzuführen, im Vergleich zu aktuellen Alternativen, wie z. B. einer Infektion über infizierte Bienenhämolymphe oder Homogenat, erheblich verringert wird, obwohl bei der Beschaffung der Bienen immer noch darauf geachtet werden sollte, die Kontamination mit Hintergrundviren zu minimieren. Die Käfigassays sind kein Ersatz für groß angelegte, feldrealistische Experimente, die die Auswirkungen von Virusinfektionen auf Kolonieebene testen, sondern dienen stattdessen als Methode zur Etablierung grundlegender viraler Reaktionen, die in Kombination mit den halbreinen Viruspartikeln als wichtige Werkzeuge zur Untersuchung verschiedener Dimensionen der physiologischen Wechselwirkungen zwischen Honigbiene und -Virus dienen können.

Die erfolgreiche Befolgung der Protokolle (Abbildungen 1) für die Puppeninjektion und die Virusextraktion sollte große Mengen an Viruspartikeln erzeugen. Die Probenahme und Injektion von Puppen, die zu mehreren Zeitpunkten aus einer Vielzahl von Kolonien stammen, maximiert jedoch die Chancen, Zielviren mit geringer Kontamination zu erwerben. Die Dynamik, durch die sich Viren innerhalb einer Honigbiene replizieren und miteinander interagieren, ist nicht gut verstanden; In Verbindung mit der Wahrscheinlichkeit einer bereits bestehenden Infektion gibt es keine Garantie dafür, dass das injizierte (gewünschte) Virus in einer bestimmten Puppe dominant wird, selbst wenn die Puppen aus derselben ursprünglichen Kolonie entnommen wurden. Abbildung 4 zeigt den potenziellen Bereich der viralen Anteile, die man nach der Extraktion erwarten könnte. Die vier gezeigten Kolonien stellen eine Teilmenge einer größeren Virusernte dar, bei der jeder Puppe zunächst ein ~ 95% israelisches Akutlähmungsvirus (IAPV) -Inokulum injiziert wurde. Obwohl 10 der 16 an diesen Extraktionen beteiligten Kolonieproben hochreines IAPV (> 95%) enthielten, darunter einige > 99% (z. B. Kolonie 1), variierten andere Proben in ihrem IAPV-Anteil (z. B. Kolonie 2-3), wobei einige sogar von anderen Viren wie dem deformierten Flügelvirus (DWV) dominiert wurden (z. B. Kolonie 4).
Tabelle 1 bietet zusätzlichen Kontext für den Amplifikationsgrad der vier Viren (BQCV,DWV, IAPV, SBV), die in Abbildung 4 in Form von RT-qPCR-Schwellenwerten (C t) (dem Punkt, an dem ein PCR-Ziel die Nachweisschwelle erreicht) und Gesamtvirusgenomäquivalenten (ge) pro 100 ng-RNA gezeigt werden. Ct-Werte können als Prädiktor für die Proportion verwendet werden, aber die Ge-Werte müssen mit einer auf einer Standardkurve basierenden Methode17 berechnet werden. Beachten Sie, dass die tatsächliche Menge der produzierten Partikel (d. h. ge) von der Anzahl der verarbeiteten Puppen und der Filterstrenge während des Extraktionsprozesses abhängt.
Viruspartikelpräparate (amplifiziertes Inokulum) sollten bei -80 °C gelagert werden und es wird empfohlen, sie aliquot zu lassen, da sie bei mehreren Frost-Tau-Zyklen signifikant abgebautwerden 18. Darüber hinaus sollten Dosis-Wirkungs-Assays immer vor dem Experimentieren durchgeführt werden, da eine Vielzahl von externen Faktoren (Bienenstockgenetik, Bienengesundheit usw.) zu einer sehr variablen Virusreaktion führen kann. Unter Verwendung von Daten aus experimentellen Käfigen (Abbildung 3) zeigt Abbildung 5 eine solche Variabilität, indem die Dosis-Wirkungs-Überlebenskurven von Honigbienen verglichen werden, die in zwei verschiedenen Jahren mit denselben IAPV-Partikeln gefüttert wurden. Trotz identischer Testparameter, einschließlich der gleichen viralen Inokula und Testkonzentrationen von 1% bis 0,01% IAPV, ergaben die 2018 (Abbildung 5A) und 2019 (Abbildung 5B) durchgeführten Studien bei allen außer der Kontrollbehandlung, die kein Virus in ihrem Saccharose-Inokulum erhielt, merklich unterschiedliche Überlebensreaktionen. Beachten Sie, dass auf Wunsch an dieser Stelle auch LD50-Berechnungen durchgeführt werden können, um genauere Mortalitätsmessungenzu erhalten 43, dies ist jedoch in der Regel nicht erforderlich, da Näherungen im Allgemeinen ausreichend sind. Im Jahr 2018 führte eine Dosis von 1% zu einem Überleben von etwa 50% nach 72 Stunden nach der Infektion (hpi) und war damit die Standardkonzentration für die meisten viralen Käfigexperimente, die in diesem Jahr durchgeführt wurden. Dieselbe Dosis erreichte jedoch im Jahr 2019 zum gleichen Zeitpunkt eine nahezu vollständige Mortalität, und infolgedessen erhielten die meisten viralen Käfigexperimente, die in diesem Jahr durchgeführt wurden, stattdessen ein IAPV-Inokulum von 0,01%. Diese signifikant niedrigere Konzentration erreichte 2018 die gleiche Mortalität wie ein 1% IAPV-Inokulum und verwendete gleichzeitig 100-mal weniger Viruspartikel.
Diese Daten wurden mit Bioassays unter Verwendung von Käfigen erstellt, die denen in Abbildung 3 ähneln. Die Futterlöcher in der Oberseite und an der Seite ermöglichen eine einfache Diätkontrolle und die Schiebekorbtür macht es einfach, Objekte wie Impftabletts oder tote Bienen hinzuzufügen oder aus der Käfigumgebung zu entfernen. Das generalisierte virale Assay-Protokoll ist jedoch nicht auf diese Arten von Käfigen oder Diätentscheidungen beschränkt und sollte an experimentelle Bedürfnisse angepasst werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61725/61725fig01.jpg"> Abbildung 1: Repräsentative Bilder verschiedener Stadien während des Larvenselbstentfernungsprotokolls. (A) Beispiel Larvenmasse, die nach der Selbstentfernungsphase über Nacht erwartet wurde (1,6). (B) Larven, die auf getrennten Injektions-/Wachstumsschalen voneinander getrennt sind (1.6.3) (C,D) Brillenaugenpuppen, die für die virale Injektion bereit sind (1.9). Braune Flecken sind getrocknete Larvenfrass, die nicht entfernt werden müssen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61725/61725fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61725/61725fig02.jpg"> Abbildung 2: Beispiel für eine Injektorvorrichtung, die durch Kombination einer Injektionsnadel mit einer Multi-Dispenser-Spitze hergestellt wird. Die Nadel und die Spitze wurden mit flüssigem Klebstoff verbunden, um konsistent 1 μL Flüssigkeitsinjektionen zu liefern, wenn sie an einem sich wiederholenden Pipetter befestigt sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61725/61725fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61725/61725fig03.jpg"> Abbildung 3: Beispielkäfig, der im Virus-Bioassay verwendet wird. Saccharoselösung und Pollen wurden während der Dauer des Versuchs ad libitum durch Feederlöcher bereitgestellt. Virus-Inokula könnte leicht mit einem Tablett geliefert werden, das durch den Boden des Käfigs eingeführt wird. Beachten Sie, dass der Käfigtyp und der Feeder-Inhalt bei Bedarf an experimentelle Parameter angepasst werden können. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61725/61725fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61725/61725fig04.jpg"> Abbildung 4: Durchschnittliche Gesamtviruslasten und -anteile über virale Präparate aus vier Probenkolonien. Die Viruslasten wurden mittels RT-qPCR als Black Queen Cell Virus (BQCV) + Deformed Wing Virus (DWV) + Israeli Acute Paralysis Virus (IAPV) + Sacbrood Virus (SBV) Genomäquivalente (ge) in 100 ng RNA gemessen. Jede Probenkolonie bestand aus 150+ homogenisierten Puppen, die ursprünglich mit IAPV injiziert wurden, und repräsentiert den typischen Bereich der Virusanteile, die aus dem Puppenvirus-Injektionsprotokoll erzeugt wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61725/61725fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61725/61725fig05.jpg"> Abbildung 5: Dosis-Wirkungs-Überlebenskurven von Honigbienen-Bioassay-Käfigen. Käfige aus den Jahren 2018 (A) und 2019 (B) wurden mit IAPV beimpft und während der gesamten Dauer der Studie ad libitum mit 30%iger Saccharoselösung gefüttert. Die Behandlungen stellen IAPV-Inokulakonzentrationen mit 10-2 bis 10-4 dar, was 1% bis 0,1% IAPV-Partikelpräparate bedeutet, die in 30% iger Saccharoselösung gemischt sind; Kontrolle Saccharose Impfungen enthielten kein Virus. n = 56 Käfige insgesamt im Jahr 2018; n = 77 Käfige insgesamt im Jahr 2019. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61725/61725fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Tabelle 1: Durchschnittliche Werte des Schwellenwertzyklus (Ct) und Genomäquivalente pro 100 ng RNA von Virusmischungen in vier viralen Präparaten aus vier Probenkolonien. Jede Probenkolonie besteht aus 150+ homogenisierten Puppen, die aus dem Puppenvirus-Injektionsprotokoll erzeugt werden. Viren wurden von RT-qPCR unter Verwendung spezifischer Primer für jedes Virus nachgewiesen. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61725/Table_1.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

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Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera

Hier beschreiben wir zwei Protokolle: Erstens, um große Mengen von nicht umhüllten Viruspartikeln der Honigbiene zu vermehren, zu extrahieren, zu reinigen und zu quantifizieren, einschließlich einer Methode zur Entfernung von Honigbienenpuppen, und zweitens, um die Auswirkungen einer Virusinfektion mit einem hochgradig wiederholbaren Käfigbioassay mit hohem Durchsatz zu testen.

Herstellung von virusangereichertem Inokulum zur oralen Infektion von Honigbienen (Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee ...

preparation-virus-enriched-inoculum-for-oral-infection-honey-bees

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees (Apis mellifera)

2.8K Aufrufe.  University of Illinois. Hier beschreiben wir zwei Protokolle: Erstens, um große Mengen von nicht umhüllten Viruspartikeln der Honigbiene zu vermehren, zu extrahieren, zu reinigen und zu quantifizieren, einschließlich einer Methode zur Entfernung von Honigbienenpuppen, und zweitens, um die Auswirkungen einer Virusinfektion mit einem hochgradig wiederholbaren Käfigbioassay mit hohem Durchsatz zu testen.

Serie: Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera

Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees (Apis mellifera)

Honeybees (Apis mellifera) are well known for their communication and orientation skills and for their impressive learning capability1,2. Because the survival of a honeybee colony depends on the exploitation of food sources, forager bees learn and memorize variable flower sites as well as their profitability. Forager bees can be easily trained in natural settings where they forage at a feeding site and learn the related signals such as odor or color. Appetitive associative learning can also be studied under controlled conditions in the laboratory by conditioning the proboscis extension response (PER) of individually harnessed honeybees3,4. This learning paradigm enables the study of the neuronal and molecular mechanisms that underlie learning and memory formation in a simple and highly reliable way5-12. A behavioral pharmacology approach is used to study molecular mechanisms. Drugs are injected systemically to interfere with the function of specific molecules during or after learning and memory formation13-16.
Here we demonstrate how to train harnessed honeybees in PER conditioning and how to apply drugs systemically by injection into the bee flight muscle.

Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees Apis mellifera

We demonstrate how to implement a behavioral pharmacology method in an appetitive olfactory conditioning paradigm in honeybees (Apis mellifera) by systemic application of drugs. This method allows investigation of the mechanisms underlying learning and memory formation in a simple and reliable way.

Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning der Proboscis Erweiterung Reaktionszeit in Honigbienen ( Apis mellifera)

Honeybees (Apis mellifera) are well known for their communication and orientation skills and for their impressive learning capability1,2. Because the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered &#34;bee-safe,&#34; there is mounting evidence that fungicide residues in pollen are associated with bee declines (for both honey and bumble bee species). While the mechanisms remain relatively unknown, researchers have speculated that bee-microbe symbioses are involved. Microbes play a pivotal role in the preservation and/or processing of pollen, which serves as nutrition for larval bees. By altering the microbial community, it is likely that fungicides disrupt these microbe-mediated services, and thereby compromise bee health. This manuscript describes the protocols used to investigate the indirect mechanism(s) by which fungicides may be causing colony decline. Cage experiments exposing bees to fungicide-treated flowers have already provided the first evidence that fungicides cause profound colony losses in a native bumble bee (Bombus impatiens). Using field-relevant doses of fungicides, a series of experiments have been developed to provide a finer description of microbial community dynamics of fungicide-exposed pollen. Shifts in the structural composition of fungal and bacterial assemblages within the pollen microbiome are investigated by next-generation sequencing and metagenomic analysis. Experiments developed herein have been designed to provide a mechanistic understanding of how fungicides affect the microbiome of pollen-provisions. Ultimately, these findings should shed light on the indirect pathway through which fungicides may be causing colony declines.

Microbial consortia within bumble bee hives enrich and preserve pollen for bee larvae. Using next generation sequencing, along with laboratory and field-based experiments, this manuscript describes protocols used to test the hypothesis that fungicide residues alter the pollen microbiome, and colony demographics, ultimately leading to colony loss.

Empirische, metagenomischen und Computertechniken beleuchten die Mechanismen, durch welche Fungizide Kompromiss Bienengesundheit

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

Umwelt

Evaluating the Effect of Environmental Chemicals on Honey Bee Development from the Individual to Colony Level

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be brought back to the beehive after the bees have foraged on flowers that have been sprayed with pesticides. Pesticide contaminated food can be exchanged between workers which then feed larvae and therefore can potentially affect the development of honey bees. Thus, residual pesticides in the environment can become a chronic damaging factor to honey bee populations and gradually lead to colony collapse. In the presented protocol, honey bee feeding methods are described and applied to either an individual honey bee or to a colony. Here, the insect growth regulator (IGR) pyriproxyfen (PPN), which is widely used to control pest insects and is harmful to the development of honey bee larvae and pupae, is used as the pesticide. The presenting procedure can be applied to other potentially harmful chemicals or honeybee pathogens for further studies.

Herein we present a method to feed pesticide contaminated food to both an individual honey bee and a beehive colony. The procedure evaluates the pesticide effect on individual honey bees by in vivo feeding of basic larval diet and also on the natural condition of beehive colony.

Die Bewertung der Wirkung von Umweltchemikalien auf Honig-Bienen-Entwicklung von der Person zu Colony Ebene

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be ...

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees (Apis mellifera L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker bees spend the first half of their life inside the dark hive, where they are nursing the larvae or building the regular hexagonal combs for food (e.g. pollen or nectar) and brood3. The antennae are extraordinary multisensory feelers and play a pivotal role in various tactile mediated tasks4, including hive building5 and pattern recognition6. Later in life, each single bee leaves the hive to forage for food. Then a bee has to learn to discriminate profitable food sources, memorize their location, and communicate it to its nest mates7. Bees use different floral signals like colors or odors7, 8, but also tactile cues from the petal surface9 to form multisensory memories of the food source. Under laboratory conditions, bees can be trained in an appetitive learning paradigm to discriminate tactile object features, such as edges or grooves with their antennae10, 11, 12, 13. This learning paradigm is closely related to the classical olfactory conditioning of the proboscis extension response (PER) in harnessed bees14. The advantage of the tactile learning paradigm in the laboratory is the possibility of combining behavioral experiments on learning with various physiological measurements, including the analysis of the antennal movement pattern.

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees Apis mellifera L.

In this protocol we show how to condition harnessed honey bees to tactile stimuli and introduce a 2D motion capture technique for analyzing the kinematics of fine-scale antennal sampling pattern.

Tactile Conditioning und Bewegungsanalyse der antennalen Sampling Strategies In Honey Bees (<em&gt; Apis mellifera</em&gt; L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker ...

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera)

This video demonstrates novel techniques of RNA interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees using double-stranded RNA (dsRNA) injections. It also presents a protocol of proboscis extension response (PER) assay for measuring gustatory perception.	
	RNAi-mediated gene knockdown is an effective technique downregulating target gene expression. This technique is usually used for single gene manipulation, but it has limitations to detect interactions and joint effects between genes. In the first part of this video, we present two strategies to simultaneously knock down two genes (called double gene knockdown). We show both strategies are able to effectively suppress two genes, vitellogenin (vg) and ultraspiracle (usp), which are in a regulatory feedback loop. This double gene knockdown approach can be used to dissect interrelationships between genes and can be readily applied in different insect species.	
	The second part of this video is a demonstration of proboscis extension response (PER) assay in honey bees after the treatment of double gene knockdown. The PER assay is a standard test for measuring gustatory perception in honey bees, which is a key predictor for how fast a honey bee's behavioral maturation is. Greater gustatory perception of nest bees indicates increased behavioral development which is often associated with an earlier age at onset of foraging and foraging specialization in pollen. In addition, PER assay can be applied to identify metabolic states of satiation or hunger in honey bees. Finally, PER assay combined with pairing different odor stimuli for conditioning the bees is also widely used for learning and memory studies in honey bees.

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees Apis mellifera

In this protocol, we describe two strategies that simultaneously suppress two genes (double gene knockdown) in honey bees. Then we present how to use the proboscis extension response (PER) assay to study the effect of double gene knockdown on honey bee gustatory perception.

RNAi-vermittelte Gene Knockdown Doppelzimmer und Gustatorisch Perception Measurement in Honey Bees (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

This video demonstrates novel techniques of RNA  interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees  using double-stranded RNA ...

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These insects are the predominant vectors of Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), a xylem-limited bacterium that is the causal agent of Pierce&#39;s disease (PD) of grapevine. Pierce&#8217;s disease is economically damaging; thus, H. vitripennis have become a target for pathogen management strategies. A dicistrovirus identified as Homalodisca coagulata virus-01 (HoCV-01) has been associated with an increased mortality in H. vitripennis populations. Because a host cell is required for HoCV-01 replication, cell culture provides a uniform environment for targeted replication that is logistically and economically valuable for biopesticide production. In this study, a system for large-scale propagation of H. vitripennis cells via tissue culture was developed, providing a viral replication mechanism. HoCV-01 was extracted from whole body insects and used to inoculate cultured H. vitripennis cells at varying levels. The culture medium was removed every 24 hr for 168 hr, RNA extracted and analyzed with qRT-PCR. Cells were stained with trypan blue and counted to quantify cell survivability using light microscopy. Whole virus particles were extracted up to 96 hr after infection, which was the time point determined to be before total cell culture collapse occurred. Cells were also subjected to fluorescent staining and viewed using confocal microscopy to investigate viral activity on F-actin attachment and nuclei integrity. The conclusion of this study is that H. vitripennis cells are capable of being cultured and used for mass production of HoCV-01 at a suitable level to allow production of a biopesticide.

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Here we present a protocol to propagate Homalodisca vitripennis cells and HoCV-1 in vitro. Medium was removed from HoCV-1 positive cultures and RNA extracted every 24 hr for 168 hr. Cell survivability was quantified by trypan blue staining. Whole virus particles were extracted post-infection. Extracted RNA was quantified by qRT-PCR.

Ausbreitung von<em&gt; Homalodisca coagulata Virus-01</em&gt; Über<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Zellkultur

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

Immunologie und Infektion

Preparation of Single-cohort Colonies and Hormone Treatment of Worker Honeybees to Analyze Physiology Associated with Role and/or Endocrine System

Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related division of labor). Young workers are engaged in nursing the brood (nurse bees), while older workers are engaged in foraging for nectar and pollen (foragers). The physiology of the workers changes in association with this role shift. For example, the main function of the hypopharyngeal glands (HPGs) changes from the secretion of major royal jelly proteins (MRJPs) to the secretion of carbohydrate-metabolizing enzymes. Because worker tasks change as the workers age in typical colonies, it is difficult to discriminate the physiological changes that occur with aging from those that occur with the role shift. To study the physiological changes in worker tissues, including the HPGs, in association with the role shift, it would be useful to manipulate the honeybee colony population by preparing single-cohort colonies in which workers of almost the same age perform different tasks. Here we describe a detailed protocol for preparing single-cohort colonies for this analysis. Six to eight days after single-cohort colony preparation, precocious foragers that perform foraging tasks earlier than usual appear in the colony. Representative results indicated role-associated changes in HPG gene expression, suggesting role-associated HPG function. In addition to manipulating the colony population, analysis of the endocrine system is important for investigating role-associated physiology. Here, we also describe a detailed protocol for treating workers with 20-hydroxyecdysone (20E), an active form of ecdysone, and methoprene, a juvenile hormone analogue. The survival rate of treated bees was sufficient to examine gene expression in the HPGs. Gene expression changes were observed in response to 20E- and/or methoprene-treatment, suggesting that hormone treatments induce physiological changes of the HPGs. The protocol for hormone treatment described here is appropriate for examining hormonal effects on worker physiology.

Here we describe our detailed protocol for the preparation of single-cohort honeybee colonies&#160;&#8211; a useful tool for analyzing the role-associated worker physiology. We also describe detailed protocols for treating workers with juvenile hormone and ecdysone to evaluate the involvement of these hormones in the regulation of worker behavior and/or physiology.

Erstellung von Einzel-Kohorte Kolonien und Hormonbehandlung von Arbeitshonigbienen Physiologie Assoziierte Analysieren mit Rolle und / oder endokrine System

Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related ...

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize and to study. Therefore, bees have long been a favored model amongst neurobiologists and neuroethologists for studying the neural basis of social and natural behavior. It is important, however, that the experimental techniques used to study bees do not interfere with the behaviors being studied. Because of this, it has been necessary to develop a range of techniques for pharmacological manipulation of honey bees. In this paper we demonstrate methods for treating restrained or free-flying honey bees with a wide range of pharmacological agents. These include both noninvasive methods such as oral and topical treatments, as well as more invasive methods that allow for precise drug delivery in either systemic or localized fashion. Finally, we discuss the advantages and disadvantages of each method and&#160;describe common hurdles and how to best overcome them. We conclude with a discussion on the importance of adapting the experimental method to the biological questions rather than the other way around.

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

This manuscript describes several protocols for administering pharmacological agents to honey bees, including simple noninvasive methods for free-flying bees, as well as more invasive variants that allow precise localized treatment of restrained bees.

Neuropharmakologische Manipulation von Verhaltene und Free-Fliegen-Honig-Bienen,<em&gt; Apis mellifera</em

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize ...

Anti-RDL and Anti-mGlutR1 Receptors Antibody Testing in Honeybee Brain Sections using CRISPR-Cas9

Cluster Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) is a gene editing technique widely used in studies of gene function. We use this method in this study to check for the specificity of antibodies developed against the insect GABAA receptor subunit Resistance to Dieldrin (RDL) and a metabotropic glutamate receptor mGlutR1 (mGluRA). The antibodies were generated in rabbits against the conjugated peptides specific to fruit flies (Drosophila melanogaster) as well to honeybees (Apis mellifera). We used these antibodies in honeybee brain sections to study the distribution of the receptors in honeybee brains. The antibodies were affinity purified against the peptide and tested with immunoblotting and the classical method of preadsorption with peptide conjugates to show that the antibodies are specific to the corresponding peptide conjugates against which they were raised. Here we developed the CRISPR-Cas9 technique to test for the reduction of protein targets in the brain 48 h after CRISPR-Cas9 injection with guide RNAs designed for the corresponding receptor. The CRISPR-Cas9 method can also be used in behavioral analyses in the adult bees when one or multiple genes need to be modified.

Presented here is a protocol to use the CRISPR-Cas9 system for reducing the production of a protein in the adult honeybee brain to test antibody specificity.

Anti-RDL und Anti-mGlutR1-Rezeptoren Antikörpertests in Honeybee Brain Sections mit CRISPR-Cas9

Cluster Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) is a gene editing technique widely used in studies of ...

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public health. Once ingested, the viruses must overcome the mosquito midgut barrier to reach the hemolymph, from where they might potentially spread to the salivary glands. When a mosquito bites, these viruses are spread to new vertebrate hosts. Similarly, the mosquito may pick up different viruses. In general, only a tiny portion of viruses may enter the salivary glands via the gut. The transmission efficiency of these viruses to the glands is be affected by the two physical barriers found in different mosquito species: midgut barriers and salivary glands barriers. This protocol presents a method for virus detection in salivary glands of Aedes aegypti&#39;s&#160;following oral feeding and intrathoracic injection infection. Furthermore, determining whether the guts and/or salivary glands hinder viral spread can aid in the risk assessments of MBVs transmitted by Aedes aegypti.

This methodology, which included oral feeding and intrathoracic injection infection, could effectively assess the influence of midgut and/or salivary gland barriers on arbovirus infection.

Experimentelle Virusinfektion bei adulten Stechmücken durch orale Fütterung und Mikroinjektion

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

Herstellung von virusangereichertem Inokulum zur oralen Infektion von Honigbienen (Apis mellifera)

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning der Proboscis Erweiterung Reaktionszeit in Honigbienen ( Apis mellifera)

Empirische, metagenomischen und Computertechniken beleuchten die Mechanismen, durch welche Fungizide Kompromiss Bienengesundheit

Die Bewertung der Wirkung von Umweltchemikalien auf Honig-Bienen-Entwicklung von der Person zu Colony Ebene

Tactile Conditioning und Bewegungsanalyse der antennalen Sampling Strategies In Honey Bees (

RNAi-vermittelte Gene Knockdown Doppelzimmer und Gustatorisch Perception Measurement in Honey Bees (

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Erstellung von Einzel-Kohorte Kolonien und Hormonbehandlung von Arbeitshonigbienen Physiologie Assoziierte Analysieren mit Rolle und / oder endokrine System

Neuropharmakologische Manipulation von Verhaltene und Free-Fliegen-Honig-Bienen,

Anti-RDL und Anti-mGlutR1-Rezeptoren Antikörpertests in Honeybee Brain Sections mit CRISPR-Cas9

Experimentelle Virusinfektion bei adulten Stechmücken durch orale Fütterung und Mikroinjektion