Protokol oluşturma sürecindeki fikirleri ve tartışmaları için Dr. Julia Fine'a ve düzenleme boyunca yararlı yorumları için Dr. Cassondra Vernier'e teşekkür ederiz. Bu materyaller, kısmen Gıda ve Tarım Araştırmaları Vakfı tarafından hibe kimliği 549025 kapsamında desteklenen projelere katkıda bulunmuştur.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Burada, larva toplama ve virüs yayılımı, ekstraksiyonu ve konsantrasyonunun yanı sıra kafes besleme deneyleri şeklinde viral tedavi de dahil olmak üzere virüs amplifikasyonu ve inokülum stok hazırlama sürecinin her adımını detaylandıran yöntemleri özetledik. Bu yöntemler, etkinliği yetişkinler için ölümcül olan virüsler için doz-yanıt mortalite testi ile tutarlı bir şekilde ölçülebilen yarı saf virüs parçacıklarının üretilmesine izin verir (<strong cla...

Bal arıları (Apis mellifera) modern küresel tarım alanında kritik bir rol oynamaktadır, ancak şu anda pestisit maruziyeti, zayıf yem, parazitler ve patojenler dahil olmak üzere biyotik ve abiyotik stresörlerin bir kombinasyonundan muzdariptir 1,2. Endişe verici en önemli patojenlerden biri, birçoğu büyük bal arısı stresörlerinden biri olan parazitik Varroa akarı (Varroa yıkıcı) tarafından vektörleştirilen virüslerdir. Bu virüsler, bal arılarında azalmış yavru sağkalımı, gelişimsel kusurlar ve felç dahil olmak üzere bir dizi olumsuz etkiye neden olabilir ve bu da kışlama dönemlerinden önce ve sonra toplam kovan çöküşüne yol açabilir 3,4,5. Virüs enfeksiyonu ile mücadelede kullanılan teknolojilerin geliştirilmesinde umut verici ilerlemeler olmasına rağmen 6,7,8,9, birçok virüsün bir bal arısı veya kolonisi içinde yayıldığı, yayıldığı ve etkileşime girdiği dinamikler hala tam olarak anlaşılamamıştır 5,10 . Bal arısı ve virüs etkileşimlerinin temel biyolojisini ve diğer çevresel faktörlerle ilişkilerini anlamak, etkili virüs yönetimi teknikleri geliştirmek için kritik öneme sahiptir.
Bununla birlikte, bal arısı-virüs etkileşimlerini incelemek, süreci zorlaştıran çok sayıda bilinen ve bilinmeyen faktörle ilgili zorluklar ortaya koymaktadır. Bunlar diyet 11,12, pestisit maruziyeti 13 ve arı genetik arka planı14,15 ile etkileşimleri içerir. Sadece virüs enfeksiyonuna odaklanıldığında bile, komplikasyonlar yaygındır, çünkü hem yönetilen hem de vahşi bal arısı popülasyonları, genellikle akut semptomlar göstermeden 16,17 ve virüs koenfeksiyonunun etkileri iyi anlaşılmamıştır18. Bu, bal arısı virüsü etkilerinin incelenmesini çözülmeyi zorlaştırmıştır.
Birçok bal arısı virüsü çalışması, arka plan enfeksiyonlarının diğer tedavilerle nasıl değiştiğini gözlemleyerek, diğer stresörlerle etkileşimleri aramak için durumsal virüs enfeksiyonlarını kullanmıştır 12,19,20,21. Bu yaklaşım, özellikle pestisit veya diyet tedavilerinin virüs seviyelerini ve replikasyonunu nasıl etkilediğini keşfetmede önemli etkileri belirlemede başarılı olsa da, bilinen içerik ve konsantrasyonun bir virüs tedavisi ile aşılama, virüs enfeksiyon dinamiklerinin deneysel olarak test edilmesi için kritik öneme sahiptir. Yine de, deneysel tedaviyi arka plan enfeksiyonundan ayırmak da zorluklar doğurabilir. Saha çalışmalarında, araştırmacılar bal arılarından bombus arılarına virüs bulaşması için kanıt sağlamak için deforme olmuş kanat virüsü (DWV) suşlarını farklılaştırdılar22, ancak bu yaklaşımı kullanmak yalnızca bal arıları içinde zor olacaktır. Virüs enfeksiyöz klonları, sadece enfeksiyonu izlemek için değil 23,24,25 değil, bal arısı virüslerinin ters genetik çalışmaları ve virüs-konakçı etkileşim araştırması 26,27,28 için de güçlü bir araçtır. Bununla birlikte, çoğu durumda, parçacıklar üretmek için hücrelerin içindeki enfeksiyon döngüsünü yerine getirmek için bulaşıcı klonlara hala ihtiyaç vardır. Bu tür parçacıklar deneysel tedaviler için inoküla olarak tercih edilir, çünkü enfektiviteleri çıplak viral RNA'dan daha yüksektir ve kapsüllenmiş genomlarla aşılama doğal bir enfeksiyonu taklit eder.
Saf, kirlenmemiş bal arısı virüsü inocula'nın (vahşi tip virüs suşları veya bulaşıcı klonlardan türetilenler) üretimi de zorluklar doğurmaktadır. Bunlar temel olarak, saf suş virüsleri üretmek için güvenilir, sürekli çoğalan, virüssüz bir bal arısı hücre hattı elde etmedeki zorluklardan kaynaklanmaktadır29,30. Bazı hücre hatları üretilirken, bu sistemler kusurlu kalır; Yine de, virüs üretiminin ve araştırmasının daha iyi kontrol edilmesini sağlayacak uygulanabilir bir hücre hattının29 üretilebileceği umudu var. Böyle bir hat yaygın olarak kullanılabilir hale gelene kadar, çoğu virüs üretim protokolü in vivo virüs üretimi ve saflaştırma18,31,32,33,34 kullanımına güvenmeye devam edecektir. Bu yaklaşımlar, ilgilenilen virüs parçacıklarını tanımlamayı ve saflaştırmayı (veya bulaşıcı bir klon üretmeyi) ve bunları genellikle pupa olarak bal arılarını enfekte etmek için kullanmayı içerir. Pupa hedef virüs ile enjekte edilir ve daha sonra kurban edilir ve daha fazla parçacık ekstrakte edilir ve saflaştırılır. Bununla birlikte, başlangıçta hiçbir arı virüssüz olmadığından, bu tür bir konsantredeki diğer virüslerin izlerinden her zaman bir dereceye kadar kontaminasyon vardır ve bu nedenle, arka plan enfeksiyonları olasılığı düşük olan arıların seçiminde büyük özen gösterilmelidir. Ayrıca, bu protokollerde kullanılmak üzere pupaları tarak hücrelerinden çıkarma yöntemleri33 çok emek yoğundur ve arılarda strese neden olabilir, bu sayede üretimi sınırlayabilir 18,32. Burada, larvaların az emek ve arılar üzerinde daha az mekanik stres ile büyük ölçekli olarak uzaklaştırılmasını sağlayan alternatif bir yöntem sunuyoruz.
Pupa elde edildikten ve başlangıç virüsü inokulumu ile enjekte edildikten sonra, virüsün çoğalmasını sağlamak için inkübe edilmeleri gerekir. Daha sonra, üretilen virüs parçacıkları, deneysel arıları enfekte etmek için kullanılabilecek bir formda işlenebilir. Bunu başarmak için, bir enfeksiyon kaynağı olarak ham homojenat35,36 veya viral olarak enfekte arılardan üretilen hemolenf kullanmak da dahil olmak üzere birkaç basit yöntem vardır37. Bu yöntemler etkilidir, ancak arka plan substratından bilinmeyen değişkenleri (örneğin, ölü arı homojenatlarındaki diğer faktörler) sokma şansı daha yüksektir. Ek olarak, bir deney kısa sürede büyük, bilinen bir virüs dozu vermeyi gerektiriyorsa, parçacıkların konsantre edilmesi arzu edilir. Bu nedenle, daha iyi kontrol için, virüs parçacıklarının bir miktar saflaştırılmasına ve konsantrasyonuna izin veren yöntemlerin kullanılması tercih edilir. Genel olarak, bir dizi yağış ve santrifüjleme adımı, neredeyse tüm olası hedef dışı virüs materyalinin çıkarılmasıyla sonuçlanacaktır33.
Bu konsantre inokulumu ürettikten sonra, viral titreleri (qPCR) ölçmek ve canlılığını ve mortaliteye neden olma yeteneğini test etmek ve enfeksiyondan sonra artan virüs titrelerinin elde edildiğini doğrulamak için in vivo biyotahlillerle karakterize etmek faydalıdır. Bu, enjeksiyon deneyleri (pupa veya yetişkinlere) veya beslenme deneyleri (larvalara veya yetişkinlere) yoluyla elde edilebilir. Tüm bu yaklaşımlar mümkün olsa da, bir kafeste yetişkin arı gruplarına beslenme genellikle en hızlı ve en basit olanıdır. Kafes testi yöntemi, pestisit toksisitesi38, yumurtalık gelişimi39 ve davranış üzerindeki beslenme etkisi 40,41 dahil olmak üzere arılar üzerindeki çeşitli diğer tedavileri test etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır ve bu nedenle, virüs enfeksiyonunu diğer faktörlerle ilişkilendiren deneyler için iyi bir temel oluşturabilir42.
Burada, arılar üzerindeki emeği ve mekanik stresi azaltan pupaları çıkarmak için bir yöntem ve viral enfeksiyon ve etkileri test etmek için oldukça tekrarlanabilir, yüksek verimli bir biyotahlil de dahil olmak üzere, pahalı bir ultrasantrifüj kullanmadan büyük miktarlarda yarı saf, yüksek oranda zenginleştirilmiş virüs parçacıkları üretmek için güvenilir bir yöntem açıklıyoruz. Viral inokulusun saflığını sıkı bir şekilde kontrol ederek, araştırmacılar bal arısı viral yanıtındaki varyasyonu diğer viral aşılama yöntemlerine göre azaltabilirler. Ayrıca, biyotahlil, viral etkileri, yönetilmesi çok daha emek yoğun olan alan gerçekçi ayarlara ölçeklendirmeden önce, yüksek oranda tekrarlanabilir deneysel birimler kullanarak küçük gruplar düzeyinde tarayabilir. Kombinasyon halinde, bu iki yöntem, bal arısı-virüsü fizyolojik etkileşimleri hakkındaki genel anlayışımızı geliştirmeye yardımcı olabilecek çalışmalar için gerekli araçları sağlar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% bleach solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24:1 chloroform:isoamyl alcohol</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>C0549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cages for bioassay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dependent on experimental setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitips Advanced 0.1 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089405</td>
			<td>Optional (if no injector appartus is available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Containers for larval self-removal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Should measure roughly 19&#34; x 9-1/8&#34; (Langstroth deep frame dimensions)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of maintaining 34 &#186;C and 50% relative humidity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>Any absorbent wipe will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium-sized weight boats</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Serve as inoculum trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcon-100kDa with Biomax membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>MPE100025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>P5119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 8000 (PEG)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>1546605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of 15,000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of 21,000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater M4 Multipipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000322</td>
			<td>Optional (if no injector appartus is available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7000TS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse-free water</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>T1375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of virus-enriched inoculum for oral infection of honey bees (apis mellifera)

Bal arıları dünya çapında büyük ekolojik ve tarımsal öneme sahiptir, ancak viral patojenlere maruz kalma da dahil olmak üzere arı sağlığını olumsuz yönde etkileyen çeşitli baskılara maruz kalmaktadır. Bu tür virüsler çok çeşitli yıkıcı etkilere neden olabilir ve deneysel tedavilerin etkilerini önceden var olan arka plan enfeksiyonundan ayırmayı zorlaştıran çoklu faktörler nedeniyle incelenmesi zor olabilir. Burada, viral enfeksiyonu ve etkileri test etmek için yüksek verimli bir biyotahlil ile birlikte büyük miktarlarda virüs parçacıklarını seri olarak üretmek için bir yöntem sunuyoruz. Sürekli, virüssüz bir bal arısı hücre hattının mevcut eksikliğinin gerektirdiği viral parçacıklar, minimum stresli metodoloji kullanılarak kovandan büyük miktarlarda ekstrakte edilen bal arısı pupaları kullanılarak in vivo olarak çoğaltılır. Bu virüs parçacıkları daha sonra inoküla canlılığını test etmek için bal arısı kafesi biyotahlillerinde ve ayrıca beslenme, böcek ilaçları ve diğer patojenlerle etkileşimler de dahil olmak üzere çeşitli diğer virüs enfeksiyon dinamiklerinde kullanılabilir. Bu tür parçacıkları kullanmanın en büyük avantajı, enfekte arı hemolenfi veya homojenat yoluyla enfeksiyon gibi mevcut alternatiflerle karşılaştırıldığında, sonraki deneylerde bilinmeyen değişkenlerin ortaya çıkma şansını büyük ölçüde azaltmasıdır, ancak arıları tedarik ederken hala dikkatli olunmalıdır. Kafes tahlilleri, koloni düzeyinde virüs enfeksiyonu etkilerini test eden büyük ölçekli, saha gerçekçi deneylerin yerine geçmez, bunun yerine, yarı saf virüs parçacıkları ile kombinasyon halinde, bal arısı-virüsü fizyolojik etkileşimlerinin çeşitli boyutlarını incelemek için önemli araçlar olarak hizmet edebilecek temel viral yanıtları oluşturmak için bir yöntem olarak işlev görür.

Pupa enjeksiyonu ve viral ekstraksiyon için protokolleri (Şekil 1) başarıyla takip etmek, büyük miktarlarda virüs parçacıkları üretmelidir. Bununla birlikte, çeşitli kolonilerden elde edilen pupaların birden fazla zaman noktasında örneklenmesi ve enjekte edilmesi, düşük kontaminasyonla hedef virüs edinme şansını en üst düzeye çıkarır. Virüslerin bir bal arısı içinde çoğaldıkları ve birbirleriyle etkileşime girdikleri dinamikler iyi anlaşılmamıştır; Önceden var o...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera at JoVE.com

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera

Burada iki protokolü tanımlıyoruz: birincisi, bal arısı pupalarını çıkarmak için bir yöntem de dahil olmak üzere, büyük miktarlarda bal arısı zarfsız virüs parçacıklarını yaymak, çıkarmak, saflaştırmak ve ölçmek ve ikincisi, yüksek oranda tekrarlanabilir, yüksek verimli bir kafes biyotahlili kullanarak viral enfeksiyonun etkilerini test etmek.

Bal Arılarının Oral Enfeksiyonu için Virüs Bakımından Zenginleştirilmiş İnokulum Hazırlanması (Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee ...

preparation-virus-enriched-inoculum-for-oral-infection-honey-bees

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees (Apis mellifera)

2.8K Görüntüleme.  University of Illinois. Burada iki protokolü tanımlıyoruz: birincisi, bal arısı pupalarını çıkarmak için bir yöntem de dahil olmak üzere, büyük miktarlarda bal arısı zarfsız virüs parçacıklarını yaymak, çıkarmak, saflaştırmak ve ölçmek ve ikincisi, yüksek oranda tekrarlanabilir, yüksek verimli bir kafes biyotahlili kullanarak viral enfeksiyonun etkilerini test etmek.

Video: Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera

Protocols for Oral Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be infected with polyhedra by droplet feeding and diet plug-based bioassays. This accompanying Springer Protocols section provides an overview of the baculovirus lifecycle and use of baculoviruses as insecticidal agents, including discussion of the pros and cons for use of baculoviruses as insecticides, and progress made in genetic enhancement of baculoviruses for improved insecticidal efficacy.

In this video, we demonstrate oral infection techniques of lepidopteran larvae with baculovirus in order to determine insecticidal efficiency.

Baculovirus lepidopteran Larva Ağız Enfeksiyon Protokolleri

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be ...

Biyoloji

Extraction of the EPP Component from the Surface EMG

A surface electromyogram (EMG), especially when recorded near the neuromuscular junction, is expected to contain the endplate potential (EPP) component which can be extracted with an appropriate signal filter. Two factors are important: the EMG must be recorded in monopolar fashion, and the recording must be done so the low frequency signal corresponding the EPP is not eliminated. This report explains how to extract the EPP component from the EMG of the masseter muscle in a human subject. The surface EMG is recorded from eight sites using traditional disc electrodes aligned along over the muscle, with equal inter-electrode distance from the zygomatic arch to the angle of mandible in response to quick gum clenching. A reference electrode is placed on the tip of the nose. The EPP component is extracted from the raw EMGs by applying a high-cut digital filter (2nd dimension Butterworth filter) with a range of 10-35 Hz. When the filter is set to 10 Hz, the extracted EPP wave deflects either negative or positive depending on the recording site. The difference in the polarity reflects the sink-source relation of the end plate current, with the site showing the most negative deflection corresponding to the neuromuscular junction. In the case of the masseter muscle, the neuromuscular junction is estimated to be located in the inferior portion close to the angle of mandible. The EPP component exhibits an interesting oscillation when the cut-off frequency of the high-cut digital filter is set to 30 Hz. The EPP oscillation indicates that muscle contraction is adjusted in an intermittent manner. Abnormal tremors accompanying various sorts of diseases may be substantially due to this EPP oscillation, which becomes slower and is difficult to cease.

The endplate potential (EPP) component can be extracted from the surface EMG using a digital filter. The extracted EPP shows oscillation with a frequency of about 30 Hz.

Yüzey EMG EPP Bileşeni çıkarımı

A surface electromyogram (EMG), especially when recorded near the neuromuscular junction, is expected to contain the endplate potential (EPP) component ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

Blastosist Fare trofoblast Kök Hücre türetilmesi

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

The pancreatic acinar cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary role in the secretion of pancreatic enzymes into the pancreatic duct. It is also the site for the initiation of pancreatitis. Here we describe how acinar cells are isolated from whole pancreas tissue and intracellular calcium signals are measured. In addition, we describe the techniques of transfecting these cells with adenoviral constructs, and subsequently measuring the leakage of lactate dehydrogenase, a marker of cell injury, during conditions that induce acinar cell injury in vitro. These techniques provide a powerful tool to characterize acinar cell physiology and pathology.

We describe a reproducible method of preparing mouse pancreatic acinar cells from a mouse for the purpose of examining acinar cell calcium signals and cellular injury with physiologically and pathologically relevant stimuli. A method for adenoviral infection of these cells is also provided.

Kalsiyum Görüntüleme amacı, Hücre Yaralanma Ölçümler ve Adenoviral Enfeksiyon için Pankreas Asiner Hücreleri hazırlanması

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Methods for Comparing Nutrients in Beebread Made by Africanized and European Honey Bees and the Effects on Hemolymph Protein Titers

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees collect and convert to beebread by placing colonies in a specially constructed enclosed flight area. Methods were developed to analyze the protein and amino acid composition of the pollen and beebread. We also describe how consumption of the beebread was measured and methods used to determine adult worker bee hemolymph protein titers after feeding on beebread for 4, 7 and 11 days after emergence. Methods were applied to determine if genotype affects the conversion of pollen to beebread and the rate that bees consume and acquire protein from it. Two subspecies (European and Africanized honey bees; EHB and AHB respectively) were provided with the same pollen source. Based on the developed methods, beebread made by both subspecies had lower protein concentrations and pH values than the pollen. In general, amino acid concentrations in beebread made by either EHB or AHB were similar and occurred at higher levels in beebread than in pollen. Both AHB and EHB consumed significantly more of the beebread made by AHB than by EHB. Though EHB and AHB consumed similar amounts of each type of beebread, hemolymph protein concentrations in AHB were higher than in EHB. Differences in protein acquisition between AHB and EHB might reflect environmental adaptations related to the geographic region where each subspecies evolved. These differences could contribute to the successful establishment of AHB populations in the New World because of the effects on brood rearing and colony growth.

Here are methods to quantify nutrients in pollen before and after its conversion to beebread by two subspecies of honeybees. We describe techniques to measure beebread consumption and resulting protein titers in both subspecies.

Africanized ve Avrupa Bal Arısı Made by beebread besin tuzu karşılaştırılması yöntemleri ve Hemolenf Protein Titrelerin Etkileri

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees ...

Bone Conditioned Medium: Preparation and Bioassay

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing bone, they also support the complex process of bone regeneration. This favorable behavior of autografts is attributed to the three characteristics: osteoconductivity, osteogenicity, and osteoinductivity. However, there is another aspect: Bone grafts release a myriad of molecules, including growth factors, which can target mesenchymal cells involved in bone regeneration. The paracrine properties of bone grafts can be studied in vitro by the use of bone-conditioned medium (BCM). Here we present a protocol on how to prepare bone-conditioned medium from native pig cortical bone, and bone that underwent thermal processing or demineralization. Cells can be directly exposed to BCM or seeded onto biomaterials, such as collagen membranes, previously soaked with BCM. We give examples for in vitro bioassays with mesenchymal cells on the expression of TGF-&#946; regulated genes. The presented protocols should encourage to further reveal the paracrine effects of bone grafts during bone regeneration and open a path for translational research in the broad field of reconstructive surgery.

We describe here how to prepare bone-conditioned medium (BCM) and test its activity in vitro.

Kemik koşullu ortam: Hazırlama ve Biyo-

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing ...

Dissection and Observation of Honey Bee Dorsal Vessel for Studies of Cardiac Function

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination services, as well as an important model social insect used to study memory and learning, aging, and more. Here we describe a detailed protocol for the dissection of the dorsal abdominal wall of a bee in order to visualize its dorsal vessel, which serves the role of the heart in the insect. A successful dissection will expose a functional heart that, under the proper conditions, can maintain a steady heartbeat for an extended period of time. This allows the investigator to manipulate heart rate through the application of cardiomodulatory compounds to the dorsal vessel. By using either a digital microscope or a microscope equipped with a digital camera, the investigator can make video recordings of the dorsal vessel before and after treatment with test compounds. The videos can then be scored at a time convenient to the user in order to determine changes in heart rate, as well as changes in the pattern of heartbeats, following treatment. The advantages of this protocol are that it is relatively inexpensive to set up, easy to learn, requires little space or equipment, and takes very little time to conduct.

The abdominal dorsal vessel of the honey bee and other insects serves as the functional equivalent of the mammalian heart and plays an important role in nutrient transport, waste removal, immune function, and more. Here we describe a protocol for the visualization and pharmacological manipulation of bee heart rate.

Kalp Fonksiyon Çalışmaları Diseksiyon ve Bal Arısı Dorsal Vessel Gözlem

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination ...

Monitoring Colony-level Effects of Sublethal Pesticide Exposure on Honey Bees

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment methods. Here we describe methods to measure the quantities of adult bees, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, by photographing frames, and by installing hives on scales and with internal sensors. Data from these periodic evaluations are then combined with running average and daily detrended data on hive weight and internal hive temperature. The resulting datasets have been used to detect colony-level effects of imidacloprid applied in a sugar syrup as low as 5 parts per billion. The methods are objective, require little training, and provide permanent records in the form of sensor output and photographs.

Sublethal doses of pesticides may affect colonies in ways that are difficult to detect using only periodic or visual methods. Methods to measure total adult bee mass, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, photographing frames, and installing sensors, are provided. Data analysis is also addressed.

Bal arıları üzerinde Sublethal pestisit pozlama koloni düzeyi etkilerinin izlenmesi

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment ...

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how fluorescent recovery after photobleaching (FRAP) and photoactivation techniques can be used to study the spatiotemporal dynamics of proteins in subcellular locations. We also show how these techniques enable straightforward determination of various parameters linked to actin cytoskeletal regulation and cell motility. Moreover, the microinjection of cells is additionally described as an alternative treatment (potentially preceding or complementing the aforementioned photomanipulation techniques) to trigger instantaneous effects of translocated proteins on cell morphology and function. Micromanipulation such as protein injection or local application of plasma membrane-permeable drugs or cytoskeletal inhibitors can serve as powerful tool to record immediate consequences of a given treatment on cell behavior at the single cell and subcellular level. This is exemplified here by immediate induction of lamellipodial cell edge protrusion by the injection of recombinant Rac1 protein, as established a quarter-century ago. In addition, we provide a protocol for determining the turnover of enhanced green fluorescent protein (EGFP)-VASP, an actin filament polymerase prominently accumulating at lamellipodial tips of B16-F1 cells, employing FRAP and including associated data analysis and curve fitting. We also present guidelines for estimating the rates of lamellipodial actin network polymerization, as exemplified by cells expressing EGFP-tagged &#946;-actin. Finally, instructions are given for how to investigate the rates of actin monomer mobility within the cell cytoplasm, followed by actin incorporation at sites of rapid filament assembly, such as the tips of protruding lamellipodia, using photoactivation approaches. None of these protocols is&#160;restricted to components or regulators of the actin cytoskeleton, but can easily be extended to explore in analogous fashion the spatiotemporal dynamics and function of proteins in various different subcellular structures or functional contexts.

We describe how micro- and photomanipulation techniques such as FRAP and photoactivation enable the determination of motility parameters and the spatiotemporal dynamics of proteins within migrating cells. Experimental readouts include subcellular dynamics and turnover of motility regulators or of the underlying actin cytoskeleton.

Morfogenetik dinamiklerini analiz ve hücre iskeleti düzenleyiciler ciro sağlayan Embriyolardan teknikleri

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the best developed model systems of infection and innate immunity. While most work has focused on systemic infections, there has been a recent increase of interest in the mechanisms of gut immunocompetence to pathogens, which require methods to orally infect flies. Here we present a protocol to orally expose individual flies to an opportunistic bacterial pathogen (Pseudomonas aeruginosa) and a natural bacterial pathogen of D. melanogaster (Pseudomonas entomophila). The goal of this protocol is to provide a robust method to expose male and female flies to these pathogens. We provide representative results showing survival phenotypes, microbe loads, and bacterial shedding, which is relevant for the study of heterogeneity in pathogen transmission. Finally, we confirm that Dcy mutants (lacking the protective peritrophic matrix in the gut epithelium) and Relish mutants (lacking a functional immune deficiency (IMD) pathway), show increased susceptibility to bacterial oral infection. This protocol, therefore, describes a robust method to infect flies using the oral route of infection, which can be extended to the study of a variety genetic and environmental sources of variation in gut infection outcomes and bacterial transmission.

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

This protocol describes methods to orally expose and infect the fruit fly Drosophila melanogaster with bacterial pathogens, and to measure the number of infectious bacteria shed following gut infection. We further describe the effect of immune mutants on fly survival following oral bacterial infection.

Bakteriyel enfeksiyon ve atma Drosophila melanogaster içinde sözlü

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the best developed model systems of infection and innate immunity. While most work has focused on systemic ...