Nous tenons à remercier la Dre Julia Fine pour ses idées et ses discussions au cours du processus de création du protocole, ainsi que la Dre Cassondra Vernier pour ses commentaires utiles tout au long de l’édition. Ces documents ont contribué à des projets qui ont été soutenus en partie par la Fondation pour la recherche sur l’alimentation et l’agriculture, dans le cadre de la subvention ID 549025.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici, nous avons décrit des méthodes détaillant chaque étape du processus d’amplification du virus et de préparation du stock d’inoculum, y compris la collecte des larves et la propagation, l’extraction et la concentration du virus, ainsi que le traitement viral sous la forme d’expériences d’alimentation en cage. Ces méthodes permettent de produire des particules virales semi-pures (figure 4), dont l’efficacité peut être quantifiée de manière cohérente par des tests de...

Les abeilles mellifères (Apis mellifera) jouent un rôle essentiel dans le paysage agricole mondial moderne, mais souffrent actuellement d’une combinaison de facteurs de stress biotiques et abiotiques, notamment l’exposition aux pesticides, le mauvais fourrage, les parasites et les agents pathogènes 1,2. L’un des agents pathogènes les plus préoccupants sont les virus, dont beaucoup sont vecteurs par un autre des principaux facteurs de stress des abeilles mellifères, l’acarien parasite Varroa (Varroa destructor). Ces virus peuvent causer une série d’effets négatifs chez les abeilles mellifères, y compris une réduction de la survie de la couvée, des défauts de développement et une paralysie qui peuvent entraîner l’effondrement total de la ruche avant et après les périodes d’hivernage 3,4,5. Bien qu’il y ait eu des progrès prometteurs dans le développement de technologies utilisées pour lutter contre l’infection virale 6,7,8,9, la dynamique par laquelle de nombreux virus se propagent, se propagent et interagissent au sein d’une abeille ou d’une colonie mellifère est encore mal comprise 5,10 . Il est essentiel de comprendre la biologie de base des interactions entre les abeilles mellifères et les virus et leurs relations avec d’autres facteurs environnementaux pour mettre au point des techniques efficaces de gestion des virus.
Cependant, l’étude des interactions abeilles-virus pose des défis avec de nombreux facteurs connus et inconnus compliquant le processus. Il s’agit notamment des interactions avec l’alimentation 11,12, l’expositionaux pesticides 13 et le fond génétique desabeilles 14,15. Même en se concentrant uniquement sur l’infection virale, les complications sont fréquentes parce que les populations d’abeilles mellifères, à la fois gérées et sauvages, ont toujours un certain degré d’infection virale de fond, bien que souvent sans manifester de symptômes aigus 16,17, et les effets de la co-infection virale ne sont pas bien compris 18. Cela a rendu l’étude des effets du virus de l’abeille mellifère difficile à démêler.
De nombreuses études sur le virus de l’abeille mellifère ont utilisé des infections virales circonstancielles pour rechercher des interactions avec d’autres facteurs de stress, en observant comment les infections de fond changent avec d’autres traitements 12,19,20,21. Bien que cette approche ait réussi à identifier des effets importants, en particulier la découverte de la façon dont les pesticides ou les traitements diététiques affectent les niveaux et la réplication du virus, l’inoculation avec un traitement par virus dont le contenu et la concentration connus est essentielle pour tester expérimentalement la dynamique de l’infection virale. Malgré cela, séparer le traitement expérimental de l’infection de fond peut également poser des défis. Dans les études sur le terrain, les chercheurs ont différencié les souches du virus des ailes déformées (DWV) pour fournir des preuves de la transmission du virus des abeilles mellifères aux bourdons22, mais l’utilisation de cette approche serait difficile chez les abeilles mellifères seules. Les clones infectieux de virus sont un outil puissant, non seulement pour le suivi de l’infection 23,24,25, mais aussi pour les études de génétique inverse des virus des abeilles mellifères et pour la recherche sur l’interaction virus-hôte 26,27,28. Cependant, dans la plupart des cas, des clones infectieux sont toujours nécessaires pour remplir le cycle d’infection à l’intérieur des cellules pour produire des particules. De telles particules sont préférées comme inocula pour les traitements expérimentaux parce que leur infectiosité est supérieure à celle de l’ARN viral nu et que l’inoculation avec des génomes encapsidés imite une infection naturelle.
La production d’inocula pur et non contaminé du virus de l’abeille mellifère (souches virales de type sauvage ou dérivées de clones infectieux) pose également des défis. Celles-ci sont principalement dues aux difficultés d’obtenir une lignée cellulaire d’abeilles mellifères fiable, se répliquant en continu et sans virus pour produire des virus de souche pure29,30. Bien que certaines lignées cellulaires aient été produites, ces systèmes restent imparfaits; Néanmoins, il y a de l’espoir qu’une lignée cellulaire viable puisse être produite29, ce qui permettrait un contrôle plus fin de la production et de l’investigation du virus. Jusqu’à ce qu’une telle ligne devienne largement disponible, la plupart des protocoles de production de virus continueront de reposer sur l’utilisation de la production et de la purification de virus in vivo 18,31,32,33,34. Ces approches consistent à identifier et à purifier les particules virales d’intérêt (ou à produire un clone infectieux) et à les utiliser pour infecter les abeilles mellifères, généralement sous forme de pupes. Les nymphes sont injectées avec le virus cible, puis sacrifiées, et d’autres particules sont extraites et purifiées. Cependant, comme aucune abeille n’est exempte de virus au départ, il y a toujours un certain degré de contamination par des traces d’autres virus dans un tel concentré et, par conséquent, il faut faire très attention au choix des abeilles présentant une faible probabilité d’infections de fond. En outre, les méthodes d’élimination des nymphes des cellules du peigne pour les utiliser dans ces protocoles33 nécessitent beaucoup de main-d’œuvre et peuvent induire un stress chez les abeilles, limitant la production par ces moyens18,32. Ici, nous rapportons une méthode alternative qui permet l’élimination à grande échelle des larves avec peu de travail et moins de stress mécanique sur les abeilles.
Une fois que les nymphes sont obtenues et injectées avec l’inoculum du virus de départ, elles doivent être incubées pour donner au virus le temps de se répliquer. Par la suite, les particules virales produites peuvent être transformées en une forme utilisable pour infecter les abeilles expérimentales. Il existe plusieurs méthodes simples pour y parvenir, notamment l’utilisation d’un homogénat brut35,36 ou d’une hémolymphe générée par des abeilles infectées par le virus comme source d’infection37. Ces méthodes sont efficaces, mais elles ont plus de chances d’introduire des variables inconnues à partir du substrat de fond (p. ex., d’autres facteurs dans les homogénats d’abeilles mortes). De plus, il est souhaitable de concentrer les particules si une expérience nécessite de donner une forte dose connue d’un virus dans un court laps de temps. Par conséquent, pour un meilleur contrôle, il est préférable d’utiliser des méthodes qui permettent un certain niveau de purification et de concentration des particules virales. En général, une série d’étapes de précipitation et de centrifugation entraînera l’élimination de presque tout le matériel viral non ciblé possible33.
Après avoir produit cet inoculum concentré, il est bénéfique de quantifier les titres viraux (qPCR) et de le caractériser avec des essais biologiques in vivo pour tester sa viabilité et sa capacité à causer la mortalité, ainsi que pour corroborer que des titres de virus accrus sont obtenus après l’infection. Cela peut être réalisé par des expériences d’injection (soit chez des pupes ou des adultes) ou des expériences d’alimentation (chez des larves ou des adultes). Bien que toutes ces approches soient possibles, nourrir des groupes d’abeilles adultes dans une cage est souvent le plus rapide et le plus simple. La méthode de dosage en cage est également largement utilisée pour tester divers autres traitements sur les abeilles, y compris la toxicité des pesticides38, le développement des ovaires39 et l’influence nutritionnelle sur le comportement40,41 et, par conséquent, peut constituer une bonne base pour des expériences liant l’infection virale à d’autres facteurs42.
Nous décrivons ici une méthode fiable pour produire de grandes quantités de particules virales semi-pures et hautement enrichies sans utiliser une ultracentrifugeuse coûteuse, y compris une méthode d’élimination des pupes qui réduit le travail et le stress mécanique sur les abeilles et un essai biologique hautement reproductible et à haut débit pour tester l’infection virale et ses effets. En contrôlant étroitement la pureté de l’inocula viral, les chercheurs sont en mesure de réduire la variation de la réponse virale des abeilles mellifères par rapport à d’autres méthodes d’inoculation virale. En outre, le bioessai peut dépister les effets viraux au niveau de petits groupes à l’aide d’unités expérimentales hautement reproductibles avant d’être mis à l’échelle vers des paramètres réalistes sur le terrain, ce qui nécessite beaucoup plus de main-d’œuvre. En combinaison, ces deux méthodes fournissent les outils nécessaires pour les études qui peuvent aider à améliorer notre compréhension globale des interactions physiologiques abeilles-virus.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% bleach solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24:1 chloroform:isoamyl alcohol</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>C0549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cages for bioassay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dependent on experimental setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitips Advanced 0.1 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089405</td>
			<td>Optional (if no injector appartus is available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Containers for larval self-removal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Should measure roughly 19&#34; x 9-1/8&#34; (Langstroth deep frame dimensions)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of maintaining 34 &#186;C and 50% relative humidity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>Any absorbent wipe will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium-sized weight boats</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Serve as inoculum trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcon-100kDa with Biomax membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>MPE100025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>P5119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 8000 (PEG)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>1546605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of 15,000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of 21,000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater M4 Multipipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000322</td>
			<td>Optional (if no injector appartus is available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7000TS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse-free water</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>T1375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of virus-enriched inoculum for oral infection of honey bees (apis mellifera)

Les abeilles mellifères sont d’une grande importance écologique et agricole dans le monde entier, mais sont également soumises à diverses pressions qui affectent négativement la santé des abeilles, y compris l’exposition à des agents pathogènes viraux. De tels virus peuvent causer une grande variété d’effets dévastateurs et peuvent souvent être difficiles à étudier en raison de multiples facteurs qui rendent difficile la séparation des effets des traitements expérimentaux de l’infection de fond préexistante. Nous présentons ici une méthode pour produire en masse de grandes quantités de particules virales ainsi qu’un essai biologique à haut débit pour tester l’infection virale et ses effets. Rendues nécessaires par l’absence actuelle d’une lignée cellulaire continue et exempte de virus, les particules virales sont amplifiées in vivo à l’aide de pupes d’abeilles mellifères, qui sont extraites de la ruche en grands volumes en utilisant une méthodologie peu stressante. Ces particules virales peuvent ensuite être utilisées dans les essais biologiques en cage d’abeilles mellifères pour tester la viabilité de l’inocula, ainsi que diverses autres dynamiques d’infection virale, y compris les interactions avec la nutrition, les pesticides et d’autres agents pathogènes. Un avantage majeur de l’utilisation de telles particules est qu’elle réduit considérablement les chances d’introduire des variables inconnues dans les expérimentations ultérieures par rapport aux alternatives actuelles, telles que l’infection par l’hémolymphe ou l’homogénat d’abeille infectée, bien qu’il faille toujours faire attention lors de l’approvisionnement des abeilles, à minimiser la contamination virale de fond. Les essais en cage ne remplacent pas les expériences réalistes à grande échelle qui testent les effets de l’infection virale au niveau de la colonie, mais fonctionnent plutôt comme une méthode pour établir des réponses virales de base qui, en combinaison avec les particules virales semi-pures, peuvent servir d’outils importants pour examiner diverses dimensions des interactions physiologiques entre les abeilles mellifères et les virus.

Le respect réussi des protocoles (figures 1) pour l’injection nymphale et l’extraction virale devrait produire de grandes quantités de particules virales. Cependant, l’échantillonnage et l’injection de pupes provenant de diverses colonies à plusieurs moments maximisent les chances d’acquérir le virus cible avec une faible contamination. La dynamique par laquelle les virus se répliquent et interagissent les uns avec les autres au sein d’une abeille mellifère n’est pas bien comprise; e...

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Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera

Nous décrivons ici deux protocoles: d’abord pour propager, extraire, purifier et quantifier de grandes quantités de particules virales non enveloppées d’abeilles mellifères, y compris une méthode pour éliminer les pupes d’abeilles mellifères et ensuite pour tester les effets de l’infection virale à l’aide d’un essai biologique en cage hautement reproductible et à haut débit.

Préparation de l’inoculum enrichi en virus pour l’infection orale des abeilles mellifères (Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees (Apis mellifera)

2.8K vues.  University of Illinois. Nous décrivons ici deux protocoles: d’abord pour propager, extraire, purifier et quantifier de grandes quantités de particules virales non enveloppées d’abeilles mellifères, y compris une méthode pour éliminer les pupes d’abeilles mellifères et ensuite pour tester les effets de l’infection virale à l’aide d’un essai biologique en cage hautement reproductible et à haut débit.

Vidéo: Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera

Protocols for Oral Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be infected with polyhedra by droplet feeding and diet plug-based bioassays. This accompanying Springer Protocols section provides an overview of the baculovirus lifecycle and use of baculoviruses as insecticidal agents, including discussion of the pros and cons for use of baculoviruses as insecticides, and progress made in genetic enhancement of baculoviruses for improved insecticidal efficacy.

In this video, we demonstrate oral infection techniques of lepidopteran larvae with baculovirus in order to determine insecticidal efficiency.

Protocoles pour l&#39;infection orale des larves de lépidoptères avec des baculovirus

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be ...

Recherche

Biologie

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

The pancreatic acinar cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary role in the secretion of pancreatic enzymes into the pancreatic duct. It is also the site for the initiation of pancreatitis. Here we describe how acinar cells are isolated from whole pancreas tissue and intracellular calcium signals are measured. In addition, we describe the techniques of transfecting these cells with adenoviral constructs, and subsequently measuring the leakage of lactate dehydrogenase, a marker of cell injury, during conditions that induce acinar cell injury in vitro. These techniques provide a powerful tool to characterize acinar cell physiology and pathology.

We describe a reproducible method of preparing mouse pancreatic acinar cells from a mouse for the purpose of examining acinar cell calcium signals and cellular injury with physiologically and pathologically relevant stimuli. A method for adenoviral infection of these cells is also provided.

Préparation des cellules acineuses pancréatiques à des fins d&#39;imagerie calcique, mesures de blessures cellulaires, et les infections à adénovirus

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Methods for Comparing Nutrients in Beebread Made by Africanized and European Honey Bees and the Effects on Hemolymph Protein Titers

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees collect and convert to beebread by placing colonies in a specially constructed enclosed flight area. Methods were developed to analyze the protein and amino acid composition of the pollen and beebread. We also describe how consumption of the beebread was measured and methods used to determine adult worker bee hemolymph protein titers after feeding on beebread for 4, 7 and 11 days after emergence. Methods were applied to determine if genotype affects the conversion of pollen to beebread and the rate that bees consume and acquire protein from it. Two subspecies (European and Africanized honey bees; EHB and AHB respectively) were provided with the same pollen source. Based on the developed methods, beebread made by both subspecies had lower protein concentrations and pH values than the pollen. In general, amino acid concentrations in beebread made by either EHB or AHB were similar and occurred at higher levels in beebread than in pollen. Both AHB and EHB consumed significantly more of the beebread made by AHB than by EHB. Though EHB and AHB consumed similar amounts of each type of beebread, hemolymph protein concentrations in AHB were higher than in EHB. Differences in protein acquisition between AHB and EHB might reflect environmental adaptations related to the geographic region where each subspecies evolved. These differences could contribute to the successful establishment of AHB populations in the New World because of the effects on brood rearing and colony growth.

Here are methods to quantify nutrients in pollen before and after its conversion to beebread by two subspecies of honeybees. We describe techniques to measure beebread consumption and resulting protein titers in both subspecies.

Méthodes de comparaison des éléments nutritifs dans gelée royale faites par africanisées et Honey Bees européenne et les effets sur hémolymphe Les titres de protéines

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees ...

Bone Conditioned Medium: Preparation and Bioassay

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing bone, they also support the complex process of bone regeneration. This favorable behavior of autografts is attributed to the three characteristics: osteoconductivity, osteogenicity, and osteoinductivity. However, there is another aspect: Bone grafts release a myriad of molecules, including growth factors, which can target mesenchymal cells involved in bone regeneration. The paracrine properties of bone grafts can be studied in vitro by the use of bone-conditioned medium (BCM). Here we present a protocol on how to prepare bone-conditioned medium from native pig cortical bone, and bone that underwent thermal processing or demineralization. Cells can be directly exposed to BCM or seeded onto biomaterials, such as collagen membranes, previously soaked with BCM. We give examples for in vitro bioassays with mesenchymal cells on the expression of TGF-&#946; regulated genes. The presented protocols should encourage to further reveal the paracrine effects of bone grafts during bone regeneration and open a path for translational research in the broad field of reconstructive surgery.

We describe here how to prepare bone-conditioned medium (BCM) and test its activity in vitro.

Os milieu conditionné: Préparation et essais biologiques

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing ...

Dissection and Observation of Honey Bee Dorsal Vessel for Studies of Cardiac Function

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination services, as well as an important model social insect used to study memory and learning, aging, and more. Here we describe a detailed protocol for the dissection of the dorsal abdominal wall of a bee in order to visualize its dorsal vessel, which serves the role of the heart in the insect. A successful dissection will expose a functional heart that, under the proper conditions, can maintain a steady heartbeat for an extended period of time. This allows the investigator to manipulate heart rate through the application of cardiomodulatory compounds to the dorsal vessel. By using either a digital microscope or a microscope equipped with a digital camera, the investigator can make video recordings of the dorsal vessel before and after treatment with test compounds. The videos can then be scored at a time convenient to the user in order to determine changes in heart rate, as well as changes in the pattern of heartbeats, following treatment. The advantages of this protocol are that it is relatively inexpensive to set up, easy to learn, requires little space or equipment, and takes very little time to conduct.

The abdominal dorsal vessel of the honey bee and other insects serves as the functional equivalent of the mammalian heart and plays an important role in nutrient transport, waste removal, immune function, and more. Here we describe a protocol for the visualization and pharmacological manipulation of bee heart rate.

Dissection et observation de Honey Bee Dorsale Navire d&#39;études de la fonction cardiaque

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination ...

Monitoring Colony-level Effects of Sublethal Pesticide Exposure on Honey Bees

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment methods. Here we describe methods to measure the quantities of adult bees, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, by photographing frames, and by installing hives on scales and with internal sensors. Data from these periodic evaluations are then combined with running average and daily detrended data on hive weight and internal hive temperature. The resulting datasets have been used to detect colony-level effects of imidacloprid applied in a sugar syrup as low as 5 parts per billion. The methods are objective, require little training, and provide permanent records in the form of sensor output and photographs.

Sublethal doses of pesticides may affect colonies in ways that are difficult to detect using only periodic or visual methods. Methods to measure total adult bee mass, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, photographing frames, and installing sensors, are provided. Data analysis is also addressed.

Surveiller les effets de la colonie-niveau d’exposition aux pesticides sublétale sur les abeilles à miel

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment ...

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how fluorescent recovery after photobleaching (FRAP) and photoactivation techniques can be used to study the spatiotemporal dynamics of proteins in subcellular locations. We also show how these techniques enable straightforward determination of various parameters linked to actin cytoskeletal regulation and cell motility. Moreover, the microinjection of cells is additionally described as an alternative treatment (potentially preceding or complementing the aforementioned photomanipulation techniques) to trigger instantaneous effects of translocated proteins on cell morphology and function. Micromanipulation such as protein injection or local application of plasma membrane-permeable drugs or cytoskeletal inhibitors can serve as powerful tool to record immediate consequences of a given treatment on cell behavior at the single cell and subcellular level. This is exemplified here by immediate induction of lamellipodial cell edge protrusion by the injection of recombinant Rac1 protein, as established a quarter-century ago. In addition, we provide a protocol for determining the turnover of enhanced green fluorescent protein (EGFP)-VASP, an actin filament polymerase prominently accumulating at lamellipodial tips of B16-F1 cells, employing FRAP and including associated data analysis and curve fitting. We also present guidelines for estimating the rates of lamellipodial actin network polymerization, as exemplified by cells expressing EGFP-tagged &#946;-actin. Finally, instructions are given for how to investigate the rates of actin monomer mobility within the cell cytoplasm, followed by actin incorporation at sites of rapid filament assembly, such as the tips of protruding lamellipodia, using photoactivation approaches. None of these protocols is&#160;restricted to components or regulators of the actin cytoskeleton, but can easily be extended to explore in analogous fashion the spatiotemporal dynamics and function of proteins in various different subcellular structures or functional contexts.

We describe how micro- and photomanipulation techniques such as FRAP and photoactivation enable the determination of motility parameters and the spatiotemporal dynamics of proteins within migrating cells. Experimental readouts include subcellular dynamics and turnover of motility regulators or of the underlying actin cytoskeleton.

Techniques de micromanipulation permettant l’analyse de la dynamique morphogénétique et chiffre d’affaires des organismes de réglementation du cytosquelette

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the best developed model systems of infection and innate immunity. While most work has focused on systemic infections, there has been a recent increase of interest in the mechanisms of gut immunocompetence to pathogens, which require methods to orally infect flies. Here we present a protocol to orally expose individual flies to an opportunistic bacterial pathogen (Pseudomonas aeruginosa) and a natural bacterial pathogen of D. melanogaster (Pseudomonas entomophila). The goal of this protocol is to provide a robust method to expose male and female flies to these pathogens. We provide representative results showing survival phenotypes, microbe loads, and bacterial shedding, which is relevant for the study of heterogeneity in pathogen transmission. Finally, we confirm that Dcy mutants (lacking the protective peritrophic matrix in the gut epithelium) and Relish mutants (lacking a functional immune deficiency (IMD) pathway), show increased susceptibility to bacterial oral infection. This protocol, therefore, describes a robust method to infect flies using the oral route of infection, which can be extended to the study of a variety genetic and environmental sources of variation in gut infection outcomes and bacterial transmission.

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

This protocol describes methods to orally expose and infect the fruit fly Drosophila melanogaster with bacterial pathogens, and to measure the number of infectious bacteria shed following gut infection. We further describe the effect of immune mutants on fly survival following oral bacterial infection.

Oral Infection bactérienne et excrétion chez Drosophila melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the best developed model systems of infection and innate immunity. While most work has focused on systemic ...

Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not accurately capture the effects of agrochemical exposure on honey bee queens. As the sole producer of fertilized eggs inside a honeybee colony, the queen is arguably the most important single member of a functioning colony unit. Therefore, understanding how agrochemicals affect queen health and productivity should be considered a critical aspect of pesticide risk assessment. Here, an adapted method is presented to expose honey bee queens and worker queen attendants to agrochemical stressors administered through a worker diet, followed by tracking egg production in the laboratory and assessing first instar eclosion using a specialized cage, referred to as a Queen Monitoring Cage. To illustrate the method&#39;s intended use, results of an experiment in which worker queen attendants were fed diet containing sublethal doses of imidacloprid and effects on queens were monitored are described.

This protocol was developed to enhance the understanding of how agrochemicals affect honey bee (Apis mellifera) reproduction by establishing methods to expose honey bee queens and their worker caretakers to agrochemicals in a controlled, laboratory setting and carefully monitoring their relevant responses.

Évaluation du risque agrochimique pour les reines d’abeilles mellifères accouplées

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward method to quickly identify the chemoattractants that could induce the chemotactic movement of rhizosphere growth-promoting bacteria on sterile glass slides via simple steps. Bacteria solution (OD600 = 0.5) and sterile chemoattractant aqueous solution were added dropwise on the glass slide at an interval of 1 cm. An inoculating loop was used to connect the chemoattractant aqueous solution to the bacterial solution. The slide was kept at room temperature for 20 min on the clean bench. Finally, the chemoattractant aqueous solution was collected for bacterial counting and microscopic observation. In this study, through multiple comparisons of experimental results, the method overcame multiple shortcomings of traditional bacterial chemotaxis methods. The method reduced the error of plate counting and shortened the experimental cycle. For the identification of chemoattractant substances, this new method can save 2-3 days compared to the traditional method. Additionally, this method allows any researcher to systematically complete a bacterial chemotaxis experiment within 1-2 days. The protocol can be considered a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Here, we present an improved chemotaxis assay protocol. The goal of this protocol is to reduce the steps and costs of traditional bacterial chemotaxis methods and to serve as a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Un test de chimiotaxie amélioré pour l’identification rapide des chimioattractifs rhizobactériens dans les exsudats racinaires

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...