La purificazione dell'affinità MS2 accoppiata con il sequenziamento dell'RNA o MAPS è stata sviluppata per identificare l'intero targetome di qualsiasi RNA di interesse per i batteri. Questa tecnologia consente di identificare qualsiasi tipo di partner sRNA indipendentemente dal meccanismo di regolazione. La caratterizzazione delle reti normative dipendenti dall'sRNA aiuterà a comprendere meglio la produzione di fattori di virulenza, la formazione di biofilm e la sopravvivenza dei batteri all'interno delle cellule ospiti e, in ultima analisi, a combattere le infezioni stafilococco.
Questo protocollo può essere applicato a qualsiasi batterio gram-positivo patogeno o non patogeno. A dimostrare la procedura sarà Noemie Mercier, dottoranda del laboratorio del Dr.Pascal Romby. Per iniziare, far crescere una colonia di ceppi che trasportano pCN51 P3 MS2 sRNA o pCN51 P3 MS2 plasmidi in tre millilitri di mezzo BHI integrati con 10 microgrammi per microliterero eriomicina in duplicati.
Diluire ogni coltura notturna in 50 millilitri di mezzo BHI fresco integrato con eringomicina per raggiungere un OD 600 di 0,05. Fai crescere le colture a 37 gradi Celsius tremando a 180 giri/min per sei ore. Trasferire ogni coltura in un tubo di centrifuga da 50 millilitri e centrifugare i tubi a 2.900 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius, quindi scartare il supernatante, congelarli e conservarli a meno 80 gradi Celsius o mantenere i pellet sul ghiaccio ed eseguire direttamente la lisi meccanica delle celle.
Per eseguire la lisi cellulare meccanica, resuspend pellets in cinque millilitri di tampone A e trasferire le cellule rimescolate in tubi di centrifuga da 15 millilitri con 3,5 grammi di perline di silice. Inserire i tubi in uno strumento dilisi a celle meccaniche ed eseguire un ciclo di 40 secondi a quattro metri al secondo. Centrifugare i tubi a 2.900 volte G per 15 minuti, quindi recuperare il supernatante e tenerlo sul ghiaccio.
Assicurarsi che il supernatante sia chiaro, ripetendo la centrifugazione in caso di allora. Rimuovere la punta della colonna, quindi inserire una colonna cromatografica in un rack di colonne e lavare la colonna con acqua ultrapura. Aggiungere 300 microlitri di resina amilosio e lavare la colonna con 10 millilitri di tampone A.Diluire 1.200 picamoli di proteine MBP-MS2 in sei millilitri del tampone A e caricarla nella colonna.
Lavare la colonna con 10 millilitri di tampone A.Next, eseguire la purificazione dell'affinità MS2. Caricare il lisato della cella nella colonna e raccogliere la frazione flow-through in un tubo di raccolta pulito. Lavare la colonna tre volte con 10 millilitri di tampone A e raccogliere la frazione di lavaggio, quindi eludere la colonna con un millilitro di tampone E e raccogliere la frazione di eluizione in un microtubo da due millilitri.
Conservare tutte le frazioni raccolte sul ghiaccio fino all'estrazione dell'RNA. Utilizzare un millilitro di ogni frazione per l'estrazione dell'RNA. Aggiungere un volume di fenolo all'RNA e mescolare vigorosamente, quindi centrifugare la miscela a 16.000 volte G per 10 minuti a 20 gradi Celsius.
Trasferire la fase superiore in un microtubo pulito da due millilitri. Aggiungere un volume di alcol isoamilico cloroformio e ripetere la centrifugazione, quindi trasferire la fase superiore in un nuovo tubo. Aggiungere 2,5 volumi di etanolo freddo al 100% e 0,1 volume di tre acetati di sodio molare a pH 5,2 e precipitare durante la notte a meno 20 gradi Celsius.
Il giorno successivo, centrifuga i tubi per 15 minuti a 16.000 volte G e quattro gradi Celsius. Rimuovere lentamente l'etanolo con una pipetta, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Aggiungere 500 microlitri di etanolo freddo all'80% e centrifuga per cinque minuti.
Scartare l'etanolo tubazione lentamente, quindi asciugare il pellet utilizzando un concentratore sottovuoto per cinque minuti in modalità di corsa. Rimescolare il pellet in un volume appropriato di acqua ultrapura. Questo protocollo è stato utilizzato per studiare il targetome RsaC in S.aureus.
Diversi mRNA che interagiscono direttamente con RsaC sono stati identificati utilizzando la tecnologia MAPS, rivelando il suo ruolo cruciale nello stress ossidativo e nelle risposte correlate ai metalli. Per confermare i costrutti di sRNA MS2 e visualizzare il loro modello di espressione, le cellule sono state raccolte dopo due, quattro e sei ore di crescita nel mezzo BHI. L'RNA è stato estratto e l'analisi della macchia settentrionale è stata eseguita utilizzando la sonda DIG specifica di RsaC.
Il livello di RsaC endogena è aumentato significativamente dopo sei ore di crescita. È importante sottolineare che il livello di MS2-RsaC 544 e MS2-RsaC 1, 116 era paragonabile a rsac endogeno a sei ore. La purificazione dell'affinità è stata eseguita e gli RRNA sono stati estratti dalle frazioni di estrazione grezza, flusso-through ed eluizione nel ceppo di tipo selvaggio che esprime solo il tag MS2 e il ceppo RsaC mutante che esprime il costrutto MS2-RsaC 544.
L'RsaC endogeno lungo 1.116 nucleotidi fu arricchito nella frazione di eluizione, ma interagiva non specificamente con la colonna di affinità a causa della sua lunghezza e della complessa struttura secondaria. L'MS2-RsaC 544 è stato altamente arricchito nella frazione di eluizione dimostrando che è stato mantenuto con successo dalla proteina di fusione MS2-MBP. Un'analisi bioinformatica ha rivelato obiettivi putativi di mRNA in base al cambiamento di piegatura tra il controllo MS2 sRNA e MS2, indicando che sodA era il primo bersaglio putativo.
Un'analisi della macchia settentrionale eseguita su sonda DIG specifica di sodA dopo la purificazione dell'affinità MS2 mostra che sodA è stato efficacemente co-arricchito con MS2-RsaC 544 rispetto al controllo MS2. Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che l'aggiunta del tag MS2 può influire sulla conferma, la stabilità o la funzione dell'sRNA. Questo dovrebbe essere attentamente monitorato.
MAPS fornisce un'istantanea dell'accoppiamento di bersagli sRNA-RNA. Un'ulteriore convalida sperimentale svelerà la loro funzione. Questa tecnica rappresenta un potente strumento per costruire reti di regolazione dell'sRNA in qualsiasi batterio.
