Questo protocollo prevede una procedura passo-passo per campionare i sottostrati di membrana perivitellina dalle uova aviari per ulteriori indagini sul loro ruolo fisiologico nella riproduzione degli uccelli. Il campionamento della membrana perivitellina è stato ottimizzato in ogni fase per limitare eventuali danni strutturali e molecolari. Il protocollo è stato ulteriormente sviluppato per la proteomica approfondita.
Inizia assaggiando lo strato di perivitellina o PL da un uovo non fecondato appena deposto. Rompere l'uovo e utilizzare un separatore di uova per separare il tuorlo dal bianco. Rimuovere le chalazae con piccole forbici e arrotolare il tuorlo su una carta da filtro per rimuovere l'albumina aderente che appare come una struttura trasparente ma visibile.
Immergere il tuorlo in un cristallizzatore contenente Tris HCL da 10 millimolare a pH otto che è stato precedentemente raffreddato a quattro gradi Celsius e rimuovere l'area PL sul disco germinale all'interno di una zona di un centimetro usando forbici smussate. Rompi il PL con piccole forbici all'interno del tampone, quindi tieni i due bordi del PL rotto con le forcep e staccalo dal tuorlo. Risciacquare il PL più volte nei bagni di Tris HCL da 10 millimolari fino a quando non è visibile alcuna traccia di tuorlo.
Assicurarsi che il PL sia pulito, bianco e fluttuante nel buffer. Elaborare il PL per la separazione del sottostrato o procedere direttamente alle analisi biochimiche. Per separare l'OPL e l'IPL, stendere l'intero campione con l'OPL rivolto verso l'alto in una piastra di Petri di plastica riempita con Tris HCL da 10 millimolare e cloruro di sodio millimolare e mantenerlo piatto con il minor numero possibile di rughe.
Determinare la posizione delle chalazae rimanenti collegate solo all'OPL. Quindi tagliare l'intero PL a pezzi di circa due per tre centimetri con piccole forbici. Separare meccanicamente i due strati con forcep di punta ultra precise sotto un microscopio sezionante.
Conservare i campioni IPL e OPL risultanti singolarmente in micro tubi a -80 gradi Celsius fino a un ulteriore utilizzo. Per eseguire la solubilizzazione primaria delle proteine, congelare i campioni IPL e OPL singolarmente per rimuovere l'acqua rimanente, quindi tagliare circa un milligrammo da ogni campione e posizionarlo all'interno di un microtubo pulito con un tappo a vite a prova di perdite. Conservare i campioni rimanenti in tubi ben chiusi per una conservazione prolungata a -20 o negativo 80 gradi Celsius.
Mescolare un milligrammo di ogni sottostrato lyofilizzato con 400 microlitri di Tris da 50 millimolare a pH sette e 500 millimolare cloruro di sodio. Utilizzare un mulino miscelatore due volte per cinque minuti a 30 Hertz per disintegrare le strutture in micro particelle e facilitare la solubilizzazione delle proteine. Raccogliere 400 microlitri dei campioni in due micro tubi puliti.
Per preparare i campioni per l'elettroforesi, aggiungere il buffer campione 5X SDS-PAGE a ogni campione di 400 microliter e riscaldarlo a 100 gradi Celsius per cinque minuti. Caricare un massimo di 20 microgrammi di proteine in ogni corsia di un gel di poliacrilammide SDS 4-20% gradiente ed eseguire l'elettroforesi a 120 volt. Dopo l'elettroforesi, rimuovere il gel dalle piastre di vetro e macchiarlo con la soluzione Coomassie Brilliant Blue per 30 minuti, quindi de-macchiare con una soluzione composta per il 50% da acqua, 40% etanolo e 10% acido acetico fino a quando lo sfondo del gel appare azzurro.
Trasferire il gel in una piastra di Petri contenente acqua deionizzata per la de-colorazione e la reidratazione. Le proteine dovrebbero apparire come bande blu con uno sfondo trasparente. Il PL è stato sottoposto a vari buffer per identificare le condizioni che consentono una perdita minima di proteine e una separazione ottimale del sottostrato.
Le proteine rilasciate a diverse concentrazioni di Tris, pH e cloruro di sodio sono mostrate qui. I due sottostrati risultanti sono stati osservati al microscopio sezionato. L'IPL è traslucido mentre l'OPL è denso, torbido e biancastro.
Dopo la separazione, OPL e IPL sono stati liofilizzati in modo indipendente e il loro contenuto proteico è stato completamente sciolto utilizzando una combinazione di macinazione meccanica, un detergente anionico, un agente riducente e bollitura. I campioni presentavano profili elettroforetici distinti su un gel di poliacrilammide. Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che la separazione dei sottostrati è un passaggio critico della procedura e deve essere eseguita utilizzando un microscopio binoculare in un tampone contenente una concentrazione minima di sale.
Per chiarire ulteriormente la loro rispettiva funzione fisiologica, i campioni di sottostrato di membrana perivitellina possono essere analizzati per la caratterizzazione istologica mediante microscopia elettronica e per studi funzionali utilizzando saggi di imaging e migrazione cellulare.
