Questo protocollo può fornire un riferimento metodologico variabile per comprendere la complicata struttura neurovascolare del dura mater cranici sulla condizione fisiologica o patologica. Sfruttando la dura mater trasparente a montaggio intero, la correlazione spettrale delle fibre nervose immunoreattive CGRP durali e dei vasi sanguigni può essere dimostrata in una vista 3D. Dopo aver eutanasiato un ratto, lo ha perfuso trascardialmente con 100 millilitri dello 0,9% di soluzione salina normale seguita da 250 a 300 millilitri di paraformaldeide al 4% in tampone di fosfato molare 0,1.
Al termine, rimuovere la pelle della testa e aprire il cranio per esporre la dura madre e il lato dorsale del cervello. Sezionare il dura mater cranici lungo il tronco encefalico fino al bulbo olfattivo in un intero modello di montaggio. Risciacquare il dura mater craniciale in tampone di fosfato molare 0,1 per circa un minuto e incubarlo in una soluzione di blocco.
Trasferire il dura mater in anticorpo anti-CGRP del topo durante la notte. Il giorno seguente, lavare il dura mater tre volte in tampone di fosfato molare 0,1. Incubare il dura mater in una soluzione mista di anticorpo secondario Alexa Fluor 488 e phalloidin 568 in 0,1.
Tampone fosfato molare contenente l'1% di siero normale di asino e lo 0,5%Tritone X-100 per 1,5 ore a temperatura ambiente. Quindi, lavare il dura mater tre volte in tampone di fosfato molare 0.1, tagliare i bordi e montarlo su vetrini al microscopio. Mettere in coperchio scivola con il 50% di glicerina prima dell'osservazione.
Immagini l'intero supporto dura mater con un microscopio fluorescente, quindi scatta immagini delle fibre nervose immunoreattive CGRP e dei vasi sanguigni etichettati con falloidina nella dura madre usando un microscopio confocale. Radere la testa del topo con un rasoio elettrico, quindi mettere le barre dell'orecchio smussate sul topo e posizionarlo sul dispositivo stereotassico. Posizionare il porta bocca e applicare un unguento oftalmico sugli occhi.
Pulire il lato chirurgico della pelle della testa utilizzando il 75% di etanolo e fare un'incisione lungo la linea mediana del cuoio capelluto. Rimuovere senza mezzi termini il periostio e i tessuti muscolari dal cranio utilizzando applicatori sterili con punta di cotone. Praticare un piccolo foro usando un trapano a bava con una punta rotonda sulle ossa parietali e temporali sinistra sopra l'arteria meningea centrale.
Costruisci una banca intorno al foro con cemento silicato dentale e aggiungi due microlitri di fluorogold nel foro intorno all'arteria meningea centrale con un microsiringe da 10 microlitri. Coprire il foro con un piccolo pezzo di spugna emostatica. Metti un pezzo di pellicola di paraffina sul foro e sigilla i bordi con cera ossea.
Suturare la ferita con filo sterile. Tenere i ratti in una zona calda fino a quando non si sono completamente ripresi. Quindi riporta i topi nelle loro gabbie.
Dopo sette giorni di sopravvivenza, perfondere questi ratti con soluzione salina normale dello 0,9%, seguita da paraformaldeide al 4% in tampone di fosfato molare 0,1. Sezionare il TG e la cervicale da uno a quattro DDG, quindi tagliarli allo spessore di 30 micrometri su un sistema di microtomi criostatici in direzione sagittale. E montare le sezioni su vetri rivestiti di silane.
Cerchiare le sezioni con una penna istochimica e incubarle per 30 minuti in soluzione di blocco. Trasferire i campioni nella soluzione di anticorpi anti-fluorogoldi e topi anti-CGRP del coniglio e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, lavare le sezioni tre volte in tampone di fosfato molare 0,1.
Incubare le sezioni lavate in una soluzione mista di anticorpo secondario Alexa Fluor 594 e anti-topo di asino Alexa Fluor 488. Quindi lavarli tre volte in tampone di fosfato molare 0,1 e applicare scivolamenti di copertura con 50% glicerina per l'osservazione. Scatta immagini dei neuroni etichettati fluorogold in TG e DRG sotto illuminazione UV usando un microscopio fluorescente.
Quindi, cattura le immagini dei neuroni etichettati fluorogold e CGRP nei TG e nei DRG. Dopo la colorazione istochimica immunofluorescente e fluorescente con CGRP e phalloidin, le fibre nervose immunoreattive CGRP e le arteriole duriali etichettate con phalloidin e i tessuti connettivi sono stati chiaramente visualizzati in tutto il montante dura mater cranico in un modello 3D. Sia le fibre nervose immunoreattive CGRP spesse che sottili corrono in parallelo alle arterie uditive intorno alla parete vascolare o tra i vasi sanguigni.
Sette giorni dopo l'applicazione del fluorogoldo sulla regione dell'arteria meningea media e della dura madre cranica del ratto, i neuroni etichettati fluorogold sono stati rilevati nei TG e nelle DRAG cervicali sul lato ipsilaterale dell'applicazione del tracciante, che è stato osservato direttamente sotto l'illuminazione UV della microscopia fluorescente. Neuroni etichettati fluorogoldi sono stati trovati in tutti e tre i rami del TG, con concentrazioni più elevate sulle divisioni oftalmiche e mascellari e con concentrazioni più basse sulla divisione mandibolare. Alcuni dei neuroni etichettati fluorogold sono stati osservati anche nelle DRG cervicali da due a tre.
Queste fotografie rappresentative a doppia immunofluorescenza mostrano neuroni sensoriali in TG e DRG. I neuroni etichettati con FG, CGRP e sia FG che CGRP sono stati visualizzati da doppia immunofluorescenza. Quando si tenta questo protocollo, ricordarsi di sezionare completamente il mater dura craniciale e incollarlo su una diapositiva in un intero modello di montaggio.
