Questo nuovo metodo di colture sferoidi può essere utilizzato per studiare la tumorigenicità per analizzare la presenza di diverse popolazioni di cellule staminali tumorali e può anche essere ben applicato attraverso lo schermo ad alto put per nuovi farmaci. Questo è un sistema colto robusto e ripetitivo per generare un gran numero di sferoidi di dimensioni omogenee. Inoltre, questi sferoidi possono essere utilizzati per studiare le cellule staminali cancerose.
Questo metodo è impostato per studiare la biologia del cancro cronico, ma può essere facilmente impostato per studiare altri tumori cambiando le condizioni della cultura 3D. Assicurati di guardare le bolle nel mezzo, di non spostare troppo il piatto durante la formazione degli sferoidi e di fare attenzione quando raccogli gli sferoidi nel colino. Inizia pretrattando i pozzi di una piastra di 24 poggia pozzo con 500 micro litri di soluzione di risciacquo anti-aderenza per pozzo.
Dopo pochi secondi centrifuga la piastra in rotore a benna oscillante e risciacqua ogni bene con 2 millilitri di mezzo basale caldo. Osservare la piastra al microscopio per assicurarsi che le bolle siano state completamente rimosse dai micro pozzi. Se non si osservano bolle, sciacquare nuovamente i pozzetti prima di aggiungere un millilitro di mezzo a matrice di membrana basale DMEM caldo a ciascun pozzo.
Per indurre la formazione di sferoidi, vedere la concentrazione desiderata di cellule Caco-2 in uno strato mono 2D in un piatto di 10 centimetri in DMEM integrato con 10%FBS e 1%antibiotici. Per la coltura a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica in un'atmosfera umidificata. Quando si raggiunge una confluenza dell'80%, lavare le cellule con cinque millilitri di PBS prima di trattare la coltura con due millilitri di Tripside-EDTA per due o cinque minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
Quando le celle si sono staccate neutralizzare la tripina con quattro millilitri di DMEM completo. Dopo il conteggio, raccogliere le cellule per centrifugazione e rimorsi la tavolozza nel volume appropriato del mezzo matrice di membrana basale DMEM per ottenere la concentrazione desiderata di cellule in un millilitro di mezzo per pozzo. Aggiungere un millilitro di cellule ad ogni pozzo della piastra prepagata di 24 pozzetti, seguita dall'aggiunta di un millilitro di media matrice di membrana basale DMEM ad ogni pozzo.
Dopo la semina, centrifugare immediatamente la piastra e utilizzare un microscopio luminoso per verificare che le cellule siano state distribuite uniformemente attraverso i micro pozzi. Quindi posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per 48 ore senza disturbare le cellule. Per raccogliere gli sferoidi, alla fine dell'incubazione, utilizzare una pipetta sierologica e metà del supernatante in ogni pozzo per rimuovere delicatamente gli sferoidi dai loro micro pozzi.
Quando tutti gli sferoidi sono stati staccati, utilizzare la pipetta per trasferire accuratamente le colture 3D da ogni pozzo a un colino reversibile da 37 micron sopra un tubo conico da 15 millilitri. Lavare ogni pozzo tre volte con un millilitro di mezzo basale prebellico per lavaggio per raccogliere eventuali sferoidi rimanenti e aggiungere questi sferoidi aggiuntivi al colino. Dopo l'ultimo lavaggio controllare la piastra al microscopio per confermare che tutti gli sferoidi sono stati rimossi dai micro pozzi.
Quindi invertire il filtro su un nuovo tubo da 15 millilitri e lavare il fondo del filtro con un mezzo a matrice di membrana seminterrato DMEM fresco per raccogliere gli sferoidi nel tubo. Gli sferoidi stanno salendo da 500 cellule a dimostrazione dell'aumento più omogeneo delle dimensioni nel tempo. Con 500 e 600 cellule per sferoide determinare come il numero ottimale di cellule in cui è possibile ottenere una buona crescita e una bassa variabilità.
L'aggiunta della matrice a membrana basale migliora la crescita e l'omogeneità degli sferoidi. Nella coltura a lungo termine, le cellule appaiono come strati multipli densi al terzo giorno. Mentre le celle appiattite disposte in strati mono sono chiaramente visibili al giorno 10.
È interessante notare che un lume appare all'interno degli sferoidi dal quinto giorno in poi. Inoltre, un chiaro aumento delle cellule positive dell'antigene nucleare a cellule proliferati si osserva ai giorni cinque e sette che diminuiscono del giorno 10. Sorprendentemente, il Caspace 3 attivato si osserva in pochissime cellule solo al terzo e al quinto giorno.
Mentre alti livelli di espressione beta-catenina si osservano in ogni momento. Il potenziale degli sferoidi di differenziarsi in Anterosite è evidenziato dalla loro espressione di Phosphatase alcalina e portasoluto 2A5 mRNA. Inoltre, questi sferoidi esprimono i tipici marcatori di cellule staminali tumorali e rispondono a trattamenti chemioterapici combinati somministrati regolarmente ai pazienti oncologici colorettali.
Quindi gli sferoidi sono composti da diverse popolazioni cellulari. Possono quindi essere ben utilizzati per analizzare le risposte specifiche delle cellule a stimoli come i refrattari e, infine, per le risposte ai farmaci.
