Questo metodo fornisce una strategia efficiente per la preparazione di impalcature funzionali per la ricerca sul tumore osseo. Decellularizzato la matrice extracelonnare ossea, ha mostrato una sierocompatibilità variabile per la sopravvivenza e le attività delle cellule osteosarcoma. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la coltura delle cellule osteosarcoma nella matrice derivata dalle ossa mostra una morfologia altamente eterogenea simile a un'istopatologia clinica dell'osteosarcoma.
Il metodo fornisce un modello ideale per indagare lo sviluppo, la progressione della sensibilità farmacologica dei tumori ossei, come l'osteosarcoma, il sarcoma di Ewing e le altre metastasi maligne dei tumori all'osso. Per iniziare, ottenere topi BALB / c di quattro o sei settimane, dopo aver eutanasiato un topo usando forbici chirurgiche sterili, tagliare fibule fresche, tibia e femore da un arto posteriore. Con l'aiuto di pinzette, staccare il tessuto epiteliale e quindi rimuovere il più possibile il tessuto molle.
Risciacquare le ossa delle gambe con una soluzione PBS sterile da 10 mM due volte per rimuovere il sangue in un piatto di sei centimetri. Immergere le ossa in un piatto con 75%etanolo per tre minuti, quindi risciacquare con PBS due volte. Conservare le ossa pulite in un tubo di centrifuga sterile da 50 millilitri con tubo PBS sterile a 80 gradi Celsius.
Scongelare le ossa congelate a temperatura ambiente e poi congelare di nuovo a 80 gradi Celsius per un'ora. Sottoposere le ossa a più di due cicli di congelamento-disgelo per la lisi cellulare e la rottura dei tessuti. Quindi, posizionare le ossa in un tubo di centrifuga sterile da 50 millilitri riempito con HCl normale 0,5 e incubare durante la notte a temperatura ambiente su uno shaker orbitale con tremori delicati per garantire una copertura completa e uniforme delle ossa.
Dopo la decalcificazione, decantare completamente la soluzione di acido cloridrico e sciacquare le ossa sotto l'acqua corrente per un'ora. Quindi, utilizzare acqua distillata per lavare le ossa due volte per 15 minuti per lavaggio su uno shaker orbitale. Decantare completamente la soluzione.
Per estrarre i lipidi in ossa demineralizzate, posizionare le ossa in un tubo di centrifuga da 50 millilitri con una miscela 1:1 di metanolo e cloroformio. Avvolgere il tubo con un foglio di stagno per evitare la luce per la prevenzione della decomposizione cloroformio. E metti il tubo su uno shaker orbitale per un'ora.
Quindi, utilizzare una pinzetta per trasferire le ossa in un altro tubo di metanolo con lamina di stagno per 30 minuti. Rimuovere completamente il metanolo e lavare con acqua distillata due volte per 15 minuti su uno shaker orbitale. Decantare l'acqua di lavaggio finale e procedere in condizioni sterili.
Risciacquare le ossa in un piatto di sei centimetri con PBS sterile per tre minuti. Aggiungere 40 millilitri di soluzione sterile 0,05%TE in un tubo di centrifuga da 50 millilitri e incubare le ossa per 23 ore in un incubatore di anidride carbonica a 37 gradi Celsius. Scartare la soluzione TE e risciacquare due volte con PBS sterile integrato con 90 g/mL di ampicillina e 90 g/mL di kanamicina per 15 minuti ciascuno sullo shaker orbitale.
Dopo aver decantato completamente il lavaggio finale, reintegrare nuovamente con 40 millilitri di PBS sterile con antibiotici. Lavare accuratamente per 24 ore a temperatura ambiente con scuotimenti delicati per ottenere un'efficace sterilizzazione degli spazi porosi. Quindi, trasferire le ossa in un tubo di centrifuga da 50 millilitri riempito con PBS sterile con antibiotici.
La matrice extracellulare ossea preparata può essere conservata a quattro gradi Celsius per due mesi. Immergere bem in 75% di etanolo in un piatto e agitare delicatamente il piatto a mano per 30 secondi. Quindi risciacquare con PBS per 30 secondi, due volte.
Trasferire il BEM su una piastra di coltura cellulare pulita a sei pozzi. Aggiungere due millilitri di mezzo di coltura completo ad ogni pozzo. Incubare il BEM durante la notte in un incubatore di anidride carbonica a 37 gradi Celsius.
Ottenere linee cellulari del sistema operativo umano in 100 microlitri di PBS prerifabburato contenenti rosso fenolo indicatore. Utilizzare una pipetta per sospendere le celle del sistema operativo con la concentrazione approssimativa di 1 per 10 al 5°. Dopo che il BEM è completamente imbevuto nel mezzo, dalle epifisi prossimali o distali, perforare l'ago alla cavità midollare di BEM e iniettare cellule del sistema operativo in BEM.
Incubare il modello OS-BEM per un minimo di due ore in un'atmosfera umidificata del 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per garantire che le cellule iniettate aderiscano saldamente al BEM. Quindi, estrae il piatto dall'incubatrice. Aggiungere un mezzo di coltura millilitro sulla piastra e tenerlo nell'incubatrice durante la notte per rivestire completamente la superficie della coltura BEM.
Trasferire delicatamente il modello OS-BEM in un nuovo pozzo di una piastra a sei pozzetti con una pinzetta sterile e rialimentare un mezzo di coltura fresco millilitro. Cultura il modello per 14 giorni nell'incubatore. Durante l'incubazione di 14 giorni, continuare a monitorare il colore medio.
Se il mezzo si trasforma in arancione, o anche giallo, aggiornare immediatamente il mezzo scartando metà del vecchio mezzo e aggiungendo un nuovo mezzo per mantenere un ambiente sano per le cellule del sistema operativo. Mantenere lo stato delle cellule di monitoraggio al microscopio a fluorescenza invertita. Quando le celle del sistema operativo si espandono a piastra, trasferire delicatamente il modello OS-BEM in un altro nuovo pozzo con pinzette sterili.
Dopo 14 giorni di coltura, sciacquare delicatamente il modello OS-BEM con PBS per rimuovere il mezzo di coltura. Quindi trasferire in un tubo di centrifuga da 15 millilitri e aggiungere la formalina tamponata al 10% da fissare per l'identificazione istologica. Dopo la demineralizzazione e la decellularizzazione, BEM sembra essere traslucido con una maggiore resilienza e tenacia rispetto all'osso nativo del topo.
Un piccolo residuo muscolare nello spazio della cavità midollare può essere chiaramente osservato. L'imaging a campo brillante dell'osso nativo e del BEM decellularizzato, mostra la rimozione completa dei nuclei cellulari. La struttura porosa naturale nella disposizione della rete di collagene è ben tenuta nel BEM decellularizzato.
Inoltre, la colorazione immunoistochimica per collagene I e collagene IV mostra che i principali componenti della matrice extracellulare sono conservati nella tibia del topo dopo la decellularizzazione. Durante la coltura di 14 giorni, sia il periostio che l'endosteo sono infiltrati dall'espansione delle cellule del sistema operativo. Le cellule del sistema operativo sul BEM decellularizzato mostrano una morfologia altamente eterogenea simile alle caratteristiche citopatologiche di una sezione del sistema operativo.
L'analisi immunoistochimica dopo la coltivazione nel modello BEM per 14 giorni mostra grandi vantaggi nelle colture a lungo termine. Inoltre, cellule del sistema operativo e coltura BEM, glicoproteina a matrice ossea altamente espressa, che è specifica per la matrice osteoide. Il modello tridimensionale di questo in vitro è stato utilizzato per dimostrare con successo un'eterogeneità fenotipico e un meccanismo regolatore di differenziazione dell'osteosarcoma.
