Questo protocollo può essere utilizzato per inattivare i geni cromosomici per isolare mutanti per lo studio della funzione genica e batteri. Rende il processo di ricombinazione omologa semplice, veloce e altamente efficiente. Utilizzando questa tecnica, i geni correlati alla virulenza del patogeno possono essere eliminati per ottenere il mutante attenuato che può essere utilizzato come candidato per il vaccino attenuato.
Inizia amplificando la cassetta di cloramfenicolo contenente frammenti di emologia del gene micC. Progettare primer avanti e indietro per amplificare la cassetta di cloramfenicolo dal plasmide PKD3, comprese 50 estensioni dell'omologia della coppia di basi dalle cinque estremità prime e tre prime del gene micC. Eseguire la PCR come descritto nel manoscritto di testo utilizzando il plasmide PKD3 come modello per amplificare la cassetta del cloramfenico.
Determinare la dimensione del prodotto PCR con elettroforesi su gel di agarosio. Quindi purificare il prodotto con un kit di recupero del gel di DNA e determinare la concentrazione di DNA mediante spettrofotometria. Effettuare una seconda reazione PCR per eliminare l'interferenza di un'ulteriore ricombinazione da parte del plasmide PKD3.
Diluire il primo prodotto PCR in un rapporto da 1 a 200 e utilizzarlo come modello per la PCR secondaria. Per costruire il primo ceppo ricombinante 50336 delta micC dot cat, mescolare 100 microlitri di cellule competenti SE 50336 con cinque microlitri di plasmide PKD 46 e incubare su ghiaccio per 30 minuti. Riscaldare la miscela a 42 gradi Celsius per 90 secondi e trasferirla rapidamente sul ghiaccio per due minuti per trasformare il plasmide nelle cellule.
Schermare le colonie positive coltivando le cellule durante la notte a 30 gradi Celsius su una piastra resistente all'ampicillina. Il giorno successivo, aggiungere altri 30 milli di L arabinosio alla coltura liquida SE 50336 PKD 46 e indurre l'espressione della ricombinasi con un'ora di incubazione a 30 gradi Celsius durante l'agitazione. Mescolare 100 nanogrammi del prodotto PCR purificato e 40 microlitri di cellule competenti SE 50336 PKD 46 in una tazza a scossa elettrica.
Quindi eseguire la trasformazione della scossa elettrica. Dopo l'elettrotrasformazione, trasferire la miscela in un millilitro di mezzo SOC e un incubatore di coltura agitante a 150 RPM e 30 gradi Celsius per un'ora. Stendere la miscela su una piastra LB resistente al cloramfenicolo e coltivare a 37 gradi Celsius durante la notte per lo screening delle colonie positive.
Coltiva le colonie positive a 42 gradi Celsius per due ore. Quindi schermare la colonia per la sensibilità all'ampicillina e la resistenza al cloramfenicolo a 37 gradi Celsius durante la notte per ottenere il primo ceppo ricombinante senza PKD 46. Dopo aver estratto il DNA genomico del gatto 50336 Delta micC dot utilizzando PCR ed elettroforesi su gel, elettroplaccare 100 nanogrammi di plasmide PCP 20 in 40 microlitri di cellule 50336 Delta micC dot cat competenti.
Trasformanti positivi dello schermo su piastre resistenti all'ampicillina e al cloramfenicolo a 30 gradi Celsius. Trasferire i trasformanti positivi in mezzo liquido LB non resistente e coltivarli durante la notte a 42 gradi Celsius. Quindi isolare singole colonie su una piastra LB a 37 gradi Celsius.
Seleziona la colonia sensibile sia all'ampicillina che al cloramfenicolo. Questo mutante è il mutante di delezione micC SE 50336 Delta micC. Verificare 50336 Delta micC eseguendo la PCR come descritto nel manoscritto di testo.
Questo protocollo è stato utilizzato per costruire il mutante di delezione 50336 Delta micC nel mutante 50336 Delta micC, pmicC. Il primo gatto ricombinante 50336 Delta micC dot è stato convalidato mediante PCR con una dimensione di banda prevista di circa 1200 coppie di basi di prodotti PCR con l'inserimento di cloramfenicolo rispetto a 279 coppie di basi nel ceppo wild type. Nella seconda ricombinazione, la cassetta del cloramfenicolo è stata eliminata dal PCP 20.
I risultati della PCR combinati con il sequenziamento hanno confermato che il mutante micC isogenico è stato costruito con successo. L'espressione dei geni ompA, ompC e ompD nei ceppi 50336, 50336 Delta micC e 50336 delta micC pmicC è stata analizzata mediante PCR quantitativa in tempo reale. La trascrizione di ompA e ompC e 50336 delta micC è aumentata di circa 2,2 volte e tre volte rispetto alla varietà wild type.
Mentre la trascrizione di ompD è aumentata solo leggermente. I test LD 50 hanno mostrato che dopo aver infettato topi BALB / c di sei-otto settimane con ciascuno dei tre ceppi, la maggior parte dei topi infettati da 50336 Delta micC ha mostrato pigrizia, inappetenza o diarrea 48 ore dopo l'infezione e sono morti dopo 96 ore. I topi infettati dal ceppo wild type e dal 50336 delta micC pmicC hanno mostrato gli stessi sintomi 72 ore dopo l'infezione e sono morti dopo 120 ore.
I LD 50 dei tre ceppi hanno indicato che la virulenza del mutante 50336 Delta micC è aumentata di 2,5 volte rispetto al tipo selvatico. Questa tecnica aiuta i ricercatori a studiare la funzione dei geni batterici e ottenere il ceppo ingegnerizzato desiderato eliminando i geni bersaglio.
