Questo lavoro è stato finanziato dal Children's Cancer Research Fund (CCRF) e dal NIH R01 AI146009 al B.S.M.

Campioni di leucferesi da donatori sani sono stati ottenuti da una banca del sangue locale. Tutti gli esperimenti qui descritti sono stati determinati come esenti per la ricerca dall'Institutional Review Board (IRB) e sono stati approvati dall'Institutional Biosafety Committee (IBC) dell'Università del Minnesota.
NOTA: Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti nel rispetto della precauzione universale per gli agenti patogeni ematici, con tecniche sterili / asettiche e adeguate apparecchiature di livello-2 di biosicurezza.
1. Preparare integratori per il mezzo di espansione delle cellule B
<ol><li>Ricostituire l'oligonucleotide CpG ad una concentrazione di 1 mg/mL.</li>
	<li>Ricostituire il ligando CD40 (CD40L) ad una concentrazione di 100 μg/mL.</li>
	<li>Ricostituire l'IL-10 umano ricombinante (rhIL-10) ad una concentrazione di 50 μg/mL.</li>
	<li>Ricostituire l'IL-15 umano ricombinante (rhIL-15) ad una concentrazione di 10 μg/mL. NOTA: Mantenere ogni integratore in piccole aliquote a -20 °C a -80 °C per un massimo di 6 mesi.</li>
</ol>2. Preparare il mezzo basale
<ol><li>Combinare il mezzo basale a cellule B con il 5% (v/v) integratore multimediale per l'espansione delle cellule immunitarie in vitro (ad esempio, CTS Immune Cell SR) e l'1% (v/v) penicillina e streptomicina.</li>
	<li>Sterilizzare il mezzo basale utilizzando un adattatore filtrante da 0,22 μm in una bottiglia sterilizzata.</li>
	<li>Mantenere il mezzo basale a 4 °C per un massimo di 1 mese.</li>
</ol>3. Preparare il mezzo di espansione delle celle B
<ol><li>Trasferire la quantità richiesta del mezzo basale in un contenitore sterile per coltura delle cellule B a 5 × 105 cellule/mL.</li>
	<li>Integrare il mezzo basale con 1 μg/mL CpG, 100 ng/mL CD40L, 50 ng/mL rhIL-10 e 10 ng/mL rhIL-15.</li>
	<li>Filtrare il mezzo di espansione della cella B utilizzando un filtro da 0,22 μm.</li>
	<li>Equilibrare il mezzo di espansione delle cellule B nell'incubatore di coltura tissutale a 37 °C, 5% CO2 con umidità per almeno 30 minuti prima dell'uso. NOTA: Preparare un nuovo mezzo di espansione b-cell da utilizzare per un giorno. Non preparare il mezzo di espansione della cella B da utilizzare per più giorni. Questa ricetta multimediale incoraggia la proliferazione delle cellule B della memoria e delle cellule B umane primarie attivate.</li>
</ol>4. Purificazione ed espansione delle cellule B umane
NOTA: Aggiungere il 99-100% di alcol isopropile a un contenitore di congelamento a temperatura controllata, seguendo le istruzioni del produttore, e raffreddare il contenitore di congelamento a 4 °C prima di iniziare il passaggio 4.1.
<ol><li>Isolare i PBBC da un campione di leucforesi
	<ol>
<li>Trasferire un campione di leucforesi (circa 8-10 ml) in un tubo conico sterile da 50 ml.</li>
		<li>Portare il volume a 35 mL con 1x soluzione salina tamponata con fosfato sterile (PBS).</li>
		<li>Sovrapporre con cura un campione di leucforesi da 35 mL su 15 mL di mezzo gradiente di densità.</li>
		<li>Centrifugare a 500 × g per 25 minuti senza freno, rimuovere lo strato plasmatico senza disturbare il cappotto buffy (strato PBMC), raccogliere i PBMC dall'interfaccia e trasferirli in un nuovo tubo conico sterile da 50 ml.</li>
		<li>Portare i PBBC a 50 mL con 1 PBS.</li>
		<li>Centrifuga a 500 × g per 5 minuti senza freno. Rimuovere il supernatante senza disturbare il pellet PBMC, che può apparire rosso.</li>
		<li>Aggiungere 7 mL di tampone di lisi ammonio-cloruro-potassio, pipettare 3 volte per mescolare bene e incubare a temperatura ambiente (RT) per 3 minuti.</li>
		<li>Portare il volume a 50 mL con 1x PBS.</li>
		<li>Centrifuga a 400 × g per 5 min con freno a bassa resistenza. Rimuovere il supernatante senza disturbare il pellet. Il pellet dovrebbe apparire rosato o bianco. NOTA: Per continuare a colturare le cellule B appena isolate, preparare il mezzo di espansione della cella B prima di iniziare l'isolamento delle cellule B (passaggio 4.2).</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento delle cellule B dai PBBC utilizzando il kit di isolamento negativo delle cellule B primarie umane
	<ol>
<li>Resuspend PBBC nel tampone di isolamento a una concentrazione di 5 × 107 celle/mL. NOTA: se il numero totale di PBBC è inferiore a 5 × 107 celle, ridimensionare il volume del buffer di isolamento per mantenere 5 × 107 celle/mL. I volumi minimi e massimi di sospensione cellulare sono rispettivamente di 0,25 mL e 8 mL.</li>
		<li>Trasferire fino a 8 mL (5 × 107 celle/ml) in un tubo sterile, polipropilene, fondo rotondo con tappo.</li>
		<li>Aggiungere 50 μL/mL di Cocktail Enhancer ai PBPC.</li>
		<li>Aggiungere 50 μL/mL di Isolation Cocktail ai PBPC, limitare il tubo e invertire 2-3 volte per mescolare.</li>
		<li>Incubare a RT per 5 min; al4° minuto di incubazione, microperline magnetiche a vortice per almeno 30 s.</li>
		<li>Trasferire 50 μL di microperline magnetiche per 1 ml di PBBC, limitare il tubo e invertire 2-3 volte per mescolare.</li>
		<li>Ricaricare fino a 10 mL con tampone di isolamento e pipettare delicatamente su e giù 2-3 volte.</li>
		<li>Posizionare il tubo in una stazione magnetica e incubare a RT per 3 minuti.</li>
		<li>Tenere insieme il magnete e il tubo e, in un unico movimento, invertire il magnete e il tubo insieme per versare la sospensione cellulare nel nuovo tubo. Scartare il vecchio tubo.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 4.2.8 (ridurre il tempo di incubazione a 2 minuti) e versare la sospensione b-cell in un tubo conico pulito.</li>
		<li>Le cellule B arricchite sono pronte all'uso. Se le cellule verranno utilizzate immediatamente, continuare alla sezione 4.3 (Espansione delle cellule B umane). Controllare la purezza delle cellule B isolate per citometria a flusso (opzionale). Se le cellule devono essere congelate prima dell'uso, continuare al passaggio 4.2.12.</li>
		<li>Per congelare le cellule B, centrifugare a 400 × g per 5 minuti e scartare il supernatante senza disturbare il pellet.</li>
		<li>Rimospend le cellule in mezzo congelante a 107 cellule/mL e aliquota 1 mL/crioviale.</li>
		<li>Posizionare il crioviale nel contenitore di congelamento refrigerato e conservare a -80 °C durante la notte; quindi, trasferire il criooviale congelato in un serbatoio di azoto liquido; mantenere le cellule congelate fino a 1 anno. NOTA: la resa prevista delle cellule B isolate è del 2%-8% dei PBBC totali, con una vitalità del 95%-99%.</li>
	</ol></li>
	<li>Espansione delle cellule B umane NOTA: se si utilizzano celle B appena isolate, ignorare i passaggi da 4.3.1 a 4.3.5. Contare le cellule e trasferire il numero richiesto di cellule in un tubo conico sterile e continuare con il passaggio 4.3.6.<ol>
<li>Siero bovino fetale pre-caldo (FBS) in un bagno d'acqua prima di scongelare le cellule B. Preparare 20 ml di mezzo di espansione delle cellule B, trasferire in un pallone T25 e pre-equilibrare il mezzo in un incubatore di coltura tissutale (a 37 °C, 5% DI CO2, con umidità) almeno 15 minuti prima dell'uso.</li>
		<li>Scongelare le cellule B in un bagno d'acqua a 37 °C. Durante l'attesa, trasferire 2 ml di FBS pre-riscaldato in un tubo conico sterile da 15 ml.</li>
		<li>Dopo che le cellule B sono state completamente scongelate, aggiungere immediatamente 1 mL di FBS pre-riscaldato, per quanto riguarda la goccia, nel campione. Incubare a RT per 1 min.</li>
		<li>Pipettare delicatamente per rimospendare il campione e trasferire l'intero volume, a goccia, in un tubo conico contenente 2 ml di FBS prerifatti.</li>
		<li>Portare il volume a 15 ml con PBS sterile 1x, cappuccio e invertire delicatamente il tubo 2-3 volte.</li>
		<li>Centrifuga a 400 × g per 5 min.</li>
		<li>Scartare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare, rimescolare il pellet cellulare con 1 mL di mezzo di espansione della cella B pre-equilibrato e contare le cellule. Il numero totale di cellule deve essere di circa 107 celle.</li>
		<li>Trasferire le cellule in un pallone contenente 20 ml del mezzo di espansione delle cellule B pre-equilibrate. La concentrazione finale delle cellule dovrebbe essere di circa 5 x 105 cellule/mL.</li>
		<li>Incubare il pallone verticalmente in un'incubatrice di coltura tissutale.</li>
		<li>Aggiornare completamente il mezzo di espansione ogni 2 giorni trasferendo l'intero volume di cellule B in un tubo conico sterile e ripetere i passaggi 4.3.6-4.3.9. NOTA: Il pallone T25 può contenere 10-20 ml di mezzo; Il pallone T75 può contenere fino a 20-60 ml di mezzo.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Ingegneria primaria delle cellule B umane
<ol><li>Progettare celle B a 48 ± 2 ore dopo l'espansione/attivazione per risultati ottimali. Preparare il mezzo di espansione delle cellule B, aliquota 1 mL del mezzo in una piastra di coltura tissutale a 48 pozze e pre-equilibrare in un incubatore di coltura tissutale almeno 15 minuti prima dell'uso. NOTA: Quando si progetta uno sgRNA CRISPR/Cas9 per un gene di interesse, seguire i passaggi descritti di seguito. - Progettare sgRNA utilizzando uno strumento online11. - Progettare sgRNA su un esone comune a tutte le isoforme della proteina. - Ordina sgRNA modificato chimicamente da aziende rispettabili. - lo sgRNA di solito si presenta in forma lëfilizzata; ricostituire lo sgRNA in tampone Tris-EDTA (TE) sterile privo di DNasi/RNasi ad una concentrazione di 1 μg/μL.</li>
	<li>Preparare il substrato transfetto CRISPR/Cas9 mescolando 1 μL (1 μg/μL) di sgRNA modificato chimicamente con 1,5 μL (1 μg/μL) di Streptococcus pyogenes Cas 9 (S.p. Cas9) di reazione di nucleasi per transfezione modificata chimicamente. Per il controllo, utilizzare 1 μL di TE buffer anziché sgRNA. NOTA: Quando lo sgRNA CD19 viene utilizzato per un esperimento gene KO, vedere la figura 2 per i risultati. Quando lo sgRNA AAVS1 viene utilizzato per un esperimento KI genico, vedere la figura 5 per i risultati.<ul>
<li>Tieni tutti i componenti sul ghiaccio.</li>
	</ul></li>
	<li>Mescolare delicatamente e trasferire 2,5 μL di substrato transfetto CRISPR/Cas9 per reazione in un tubo di un nastro a 8 tubi da 0,2 ml; accantonato a RT.</li>
	<li>Accendere un nucleofector (elettroporatore) e preparare i reagenti di trasfezione, come mostrato nella tabella 1. NOTA: Questo è un buon passo per una pausa, se necessario, mettendo tutti i reagenti sul ghiaccio. Rimuovere tutti i reagenti dal ghiaccio quando sono pronti a riprendere l'esperimento. Quando si utilizza la proteina S.p. Cas9, lo sperimentatore DEVE pre-complesso CRISPR/Cas9-sgRNA ribonucleoproteina mescolando 1 μg di sgRNA con 5 μg di proteina S.p. Cas9, evitando eventuali bolle e incubando la miscela a RT per almeno 20 minuti prima dell'uso per risultati ottimali.</li>
	<li>Contare e trasferire 106 cellule B per reazione di trasfezione in un tubo conico sterile.</li>
	<li>Portare il volume a 15 mL con PBS sterile 1x e centrifugare a 400 × g per 5 min. Durante l'attesa, preparare il reagente di trasfezione della cella primaria (tabella 2) e accantonare a RT.</li>
	<li>Scartare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare.</li>
	<li>Rimossare il pellet cellulare con 10 mL di PBS sterile 1x e centrifuga a 400 × g per 5 min.</li>
	<li>Scartare completamente il supernatante senza disturbare il pellet cellulare.</li>
	<li>Trasferire 0,5 μg di mRNA GFP modificato chimicamente (come reporter di trasfezione) per 106 cellule B al pellet cellulare (opzionale).</li>
	<li>Resopend il pellet cellulare con reagente di trasfezione a cellule primarie da 20 μL per 106 cellule B; mescolare delicatamente pipettando 5-6 volte. Trasferire 20,5 μL per reazione di trasfezione nel tubo da 0,2 ml della striscia a 8 tubi contenente 2,5 μL del substrato di trasfezione CRISPR/Cas9.</li>
	<li>Pipetta su e giù una volta per mescolare e trasferire l'intero volume (23 μL) in una cuvetta di trasfezione. Cappuccio e toccare delicatamente la cuvetta sulla panca per assicurarsi che il liquido copra il fondo della cuvetta.</li>
	<li>Utilizzare il protocollo b-cell primario umano sul nucleofector per la trasfezione. NOTA: Il nucleofector (elettroporatore) può essere posizionato ed essere utilizzato al di fuori della cappa di coltura tissutale. Limitare la cuvetta per garantire la sterilità.</li>
	<li>Riposare le celle elettroporate nella cuvetta a RT per 15 minuti.</li>
	<li>Trasferire 80 μL del mezzo di espansione pre-equilibrato della cellula B dalla piastra di coltura tissutale nella reazione di trasfezione nella cuvetta. Posizionare la cuvetta nell'incubatore di coltura tissutale per 30 minuti.</li>
	<li>Pipettare delicatamente un paio di volte per mescolare e trasferire l'intero volume del campione dalla cuvetta ad un pozzo appropriato di una piastra di coltura tissutale a 48 pozzi contenente 1 mL del mezzo di espansione della cellula B. La concentrazione finale delle cellule dovrebbe essere di 106 cellule/mL.</li>
	<li>Se si esegue un esperimento KI genico, trasferire il vettore rAAV6 a 500.000 molteplicità di infezione nelle cellule elettroporate appropriate contenenti bene (circa 45 minuti dopo l'elettroporazione). Vedere esempio di costrutto vettoriale rAAV6 nella figura 4A. NOTA: Ad esempio: un campione di controllo verrà elettroporato senza CRISPR/Cas9 o il vettore rAAV6. Un campione solo vettoriale sarà elettroporato senza CRISPR/Cas9 e quindi trasdotto con il vettore rAAV6. Un campione KI verrà elettroporato con CRISPR/Cas9 e quindi trasdotto con il vettore rAAV6. rAAV6 deve contenere bracci di omologia verso l'alto e a valle del sito DSB mirato per HDR.</li>
	<li>Posizionare la piastra in un incubatore di coltura tissutale a 37 °C e al 5% di CO2 con umidità.</li>
	<li>Conta le celle e registra la vitalità al primo giorno dopo l'ingegneria.</li>
	<li>Aggiornare il mezzo di espansione della cella B ogni 2 giorni contando le celle e quindi trasferendo l'intero volume delle celle in un tubo di microcentrifugo pulito da 1,5 ml. Centrifugare a 400 × g per 5 minuti e scartare il supernatante senza disturbare il pellet. Rimostrare le cellule con 100 μL di mezzo di espansione fresco delle cellule B e trasferirli in un pozzo di una piastra di coltura tissutale di 24 po '. Portare il volume medio per ottenere una concentrazione cellulare finale a 5 × 105 cellule/mL. NOTA: Una piastra da 48 porsi può contenere fino a 1 mL medio/bene; una piastra da 24 po' può contenere fino a 2 mL medio/bene; una piastra da 12 po' può contenere fino a 4 mL medio/bene e una piastra da 6 po po' può contenere fino a 8 mL medio/bene.</li>
	<li>Consentire alle celle ingegnerizzate di espandersi per almeno 5 giorni prima di eseguire analisi a valle, ad esempio per l'analisi della citometria del flusso, l'analisi TIDE e la PCR di giunzione.</li>
</ol>

<ol>
	<li>LeBien, T. W., Thomas, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes:+how+they+develop+and+function.">B lymphocytes: how they develop and function.</a> Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).</li><li>Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+antibody-secreting+plasma+cells.">The generation of antibody-secreting plasma cells.</a> Nature Reviews Immunology. 15, 160-171 (2015).</li><li>Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. K., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humoral+immunity+due+to+long-lived+plasma+cells.">Humoral immunity due to long-lived plasma cells.</a> Immunity. 8 (3), 363-372 (1998).</li><li>Spriggs, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+human+CD40+ligand+stimulates+B+cell+proliferation+and+immunoglobulin+E+secretion.">Recombinant human CD40 ligand stimulates B cell proliferation and immunoglobulin E secretion.</a> Journal of Experimental Medicines. 176 (6), 1543-1550 (1992).</li><li>Fusil, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lentiviral+vector+allowing+physiologically+regulated+membrane-anchored+and+secreted+antibody+expression+depending+on+B-cell+maturation+status.">A lentiviral vector allowing physiologically regulated membrane-anchored and secreted antibody expression depending on B-cell maturation status.</a> Molecular Therapy. 23 (11), 1734-1747 (2015).</li><li>Luo, X. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+human+hematopoietic+stem/progenitor+cells+to+produce+a+broadly+neutralizing+anti-HIV+antibody+after+in+vitro+maturation+to+human+B+lymphocytes.">Engineering human hematopoietic stem/progenitor cells to produce a broadly neutralizing anti-HIV antibody after in vitro maturation to human B lymphocytes.</a> Blood. 113 (7), 1422-1431 (2008).</li><li>Mock, U., Thiele, R., Uhde, A., Fehse, B., Horn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+lentiviral+transduction+and+transgene+expression+in+primary+human+B+cells.">Efficient lentiviral transduction and transgene expression in primary human B cells.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (6), 408-415 (2012).</li><li>Heltemes-Harris, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+Beauty+transposon+screen+identifies+signaling+modules+that+cooperate+with+STAT5+activation+to+induce+B-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">Sleeping Beauty transposon screen identifies signaling modules that cooperate with STAT5 activation to induce B-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Oncogene. 35 (26), 3454-3464 (2016).</li><li>Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+primary+human+B+cells+with+CRISPR/Cas9+targeted+nuclease.">Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease.</a> Scientific Reports. 8, 12144 (2018).</li><li>Hung, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+protein-secreting+plasma+cells+by+homology-directed+repair+in+primary+human+B+cells.">Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells.</a> Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).</li><li>Cui, Y., Xu, J., Cheng, M., Liao, X., Peng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+CRISPR/Cas9+sgRNA+design+tools.">Review of CRISPR/Cas9 sgRNA design tools.</a> Interdisciplinary Sciences. 10 (2), 455-465 (2018).</li><li>Rees, H. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Base+editing:+precision+chemistry+on+the+genome+and+transcriptome+of+living+cells.">Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (12), 770-788 (2018).</li><li>Spiegel, A., Bachmann, M., Jurado Jim&#233;nez, G., Sarov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-based+knockout+pipeline+for+reverse+genetics+in+mammalian+cell+culture.">CRISPR/Cas9-based knockout pipeline for reverse genetics in mammalian cell culture.</a> Methods. 164-165, 49-58 (2019).</li><li>Suzuki, T., Kazuki, Y., Oshimura, M., Hara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+system+for+simultaneous+or+sequential+integration+of+multiple+gene-loading+vectors+into+a+defined+site+of+a+human+artificial+chromosome.">A novel system for simultaneous or sequential integration of multiple gene-loading vectors into a defined site of a human artificial chromosome.</a> PLoS One. 9, 110404 (2014).</li><li>Bak, R. O., Porteus, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+integration+of+large+gene+cassettes+using+AAV+donor+vectors.">CRISPR-mediated integration of large gene cassettes using AAV donor vectors.</a> Cell Reports. 20 (3), 750-756 (2017).</li><li>Shirley, J. L., de Jong, Y. P., Terhorst, C., Herzog, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+viral+gene+therapy+vectors.">Immune responses to viral gene therapy vectors.</a> Molecular Therapy. 28 (3), 709-722 (2020).</li><li>Martino, A. T., Markusic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+mechanisms+against+AAV+vectors+in+animal+models.">Immune response mechanisms against AAV vectors in animal models.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 17, 198-208 (2020).</li></ol>

È stato depositato un brevetto sui metodi di produzione e utilizzo di cellule B modificate dal genoma con M.J.J, K.L., e B.S.M. come inventori. Immusoft Inc.M ha sponsorizzato la ricerca nel laboratorio di B.S.M.

L'ingegneria del genoma precisa nelle cellule B umane primarie è stata impegnativa fino apoco tempo fa 9,10. In precedenza avevamo pubblicato protocolli che utilizzavano CRISPR/Cas9 per progettare cellule B umane primarie9. Qui, delineamo protocolli migliorati per l'isolamento, l'espansione e l'ingegneria delle celle B per consentire un KO efficiente del CD19 o per l'eGFPknocking-in .
Qui dimostriamo c...

Le cellule B sono un sottogruppo del linfocita derivato dalle cellule staminali ematopoietiche. Svolgono un ruolo fondamentale nel sistema immunitario umoristico adattivo producendo grandi quantità di anticorpi in risposta alle sfide immunitarie1. Le cellule B sono anche precursori delle cellule B della memoria e delle cellule plasmatiche di lunga durata differenziate e terminali, fornendo così un'immunità umorale duratura2. Le cellule plasmatiche, in particolare, sono uniche tra le cellule immunitarie nella loro capacità di produrre grandi quantità di un anticorpo specifico mentre sopravvivono per anni odecenni 3. Inoltre, la facilità di isolamento dal sangue periferico rende il lignaggio delle cellule B un ottimo candidato per nuove terapie a base cellulare4.
In precedenza, metodi di integrazione casuali, come quelli che utilizzano vettori lentivirali o un transposone della Bella Addormentata, sono stati utilizzati per progettare cellule B per la consegna transgena el'espressione 5,6,7,8. Tuttavia, la natura non specifica di questi approcci rende difficile studiare le funzioni biologiche di un gene specifico nelle cellule B e comporta un rischio intrinseco di mutagenesi inserimento ed espressione transgena variabile e/o silenziamento nell'ambiente terapeutico.
Il sistema CRISPR/Cas9 è un potente strumento di ingegneria genomica che consente ai ricercatori di modificare con precisione il genoma di varie cellule in numerose specie. Recentemente, due gruppi, tra cui il nostro, hanno sviluppato con successo metodi per l'espansione ex vivo e l'ingegneria genomica mirata delle cellule Bumane primarie 9,10. Descriveremo il processo di purificazione delle cellule B umane primarie da un campione di leucforesi. Successivamente, descriveremo il nostro protocollo aggiornato per l'espansione delle celle B e l'attivazione di celle B isolate. Descriveremo quindi un processo per eliminare il cluster di differenziazione 19 (CD19), uno specifico recettore delle cellule B e un segno distintivo delle cellule B, per elettroporazione per introdurre l'mRNA CRISPR /Cas9 insieme allo sgRNA CD19 nelle cellule B attivate.
Cas9 mRNA viene tradotto e si lega allo sgRNA CD19 per formare un complesso crispr/cas9-sgRNA ribonucleoproteina (RNP). Successivamente, lo sgRNA nel complesso porta Cas9 a creare una rottura a doppio filamento (DSB) alla sequenza bersaglio sull'esone 2 del gene. Le cellule ripareranno il DSB "unendo fine non omologha" introducendo o eliminando i nucleotidi, portando a mutazioni frameshift e causando l'eliminazione del gene. Misureremo quindi la perdita di CD19 per citometria del flusso e analizzeremo la formazione di indelenze tracciando le indeli mediante analisi di decomposizione (TIDE).
Descriveremo quindi il processo di utilizzo di CRISPR/Cas9 insieme a un vettore AAV6 ricombinante (rAAV6, un modello donatore per la riparazione diretta dall'omologia (HDR)) per mediare l'inserimento specifico del sito di proteine fluorescenti verdi avanzate(EGFP) nel gene 1 (AAVS1) adeno-associato al virus. Il gene AAVS1 è un locus attivo senza funzioni biologiche note e un sito di integrazione virale AAV sul genoma umano; pertanto, è considerato un "porto sicuro" per l'ingegneria del genoma. Qui, segnalamo che l'espansione e l'attivazione delle cellule B hanno permesso un'espansione fino a 44 volte in 7 giorni di coltura (Figura 1). L'elettroporazione delle cellule B ha mostrato una leggera riduzione della salute generale delle cellule(figura 2A)a 24 ore dopo la trasfezione. L'analisi del grafico a dispersione del marcatore CD19 (Figura 2B) ha mostrato una riduzione fino all'83% delle celle modificate (Figura 2C).
L'analisi TIDE dei cromatografi(figura 3A)ha rivelato che la % delle indeli era simile alla perdita di proteine % per citometria del flusso(figura 3B). L'analisi della citometria del flusso dell'esperimento KI ha mostrato che le cellule che hanno ricevuto vettore AAV (Figura 4), insieme all'RNP, hanno espresso fino al 64% di cellule positive all'EGFP (Figura 5A) e in seguito hanno mostrato un'integrazione riuscita mediante reazione a catena della polimerasi di giunzione (PCR)(Figura 5B). Il conteggio delle celle ha mostrato che tutti i campioni sono stati rapidamente recuperati entro 3 giorni dopo l'ingegneria (Figura 5C).

<table><tbody><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug</td><td>IDT</td><td>1081059</td><td>smaller size is also available</td></tr><tr><td>Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT)</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer</td><td>Quality Biological</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>CleanCap chemically modified Cas9 mRNA</td><td>Trilink Biotechnology</td><td>L-7206-1000</td><td></td></tr><tr><td>CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg</td><td>Invivogen</td><td>TLRL-2006-5</td><td>different sizes available</td></tr><tr><td>Cryostor CS10, 100 mL</td><td>STEMCELL Technology</td><td>7930</td><td></td></tr><tr><td>CTS Immune Cell SR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A2596101</td><td></td></tr><tr><td>EasySep human B cells isolation kit</td><td>STEMCELL Technology</td><td>17954</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience fixable viability dye eFlour 780</td><td>eBiosciences</td><td>65-0865-14</td><td></td></tr><tr><td>Excellerate B cell media, Xeno-free</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>CCM031</td><td>B-cell basal medium</td></tr><tr><td>Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube</td><td>Corning</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>S11550</td><td>For thawing B cells only</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>GeneMate SnapStrip&amp;reg; 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps</td><td>BioExpress</td><td>T-3035-1 / 490003-692</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS</td><td>GE lifesciences</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Lonza 4D Nucleofector core unit</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002B</td><td></td></tr><tr><td>Lonza 4D Nucleofector X unit</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002X</td><td></td></tr><tr><td>Mega CD40 Ligand</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-522-110-C010</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1562-1EA</td><td>For freezing cells</td></tr><tr><td>Pen/Strep 100X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TMS-AB2-C</td><td></td></tr><tr><td>PerCP anti-human CD19 clone HIB19</td><td>biolegend</td><td>302228</td><td>smaller size is also available</td></tr><tr><td>rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.)</td><td>Vigene Biosciences</td><td>N/A</td><td>large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL</td></tr><tr><td>Recombinant human IL-10 protein 250 ug</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>217-IL-250</td><td>different sizes available</td></tr><tr><td>Recombinant human IL-15 protein 25 ug</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>247-ILB-025</td><td>different sizes available</td></tr><tr><td>The Big Easy EasySep Magnet</td><td>STEMCELL Technology</td><td>18001</td><td>different sizes available</td></tr><tr><td>Tris-EDTA (TE) buffer</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2476100</td><td></td></tr></tbody></table>

genome engineering of primary human b cells using crispr/cas9

Le cellule B sono linfociti derivati da cellule staminali ematopoietiche e sono una componente chiave del braccio umoristico del sistema immunitario adattivo. Fanno candidati attraenti per le terapie a base cellulare a causa della loro facilità di isolamento dal sangue periferico, della loro capacità di espandersi in vitro e della loro longevità in vivo. Inoltre, la loro normale funzione biologica - per produrre grandi quantità di anticorpi - può essere utilizzata per esprimere grandi quantità di una proteina terapeutica, come un anticorpo ricombinante per combattere l'infezione, o un enzima per il trattamento delle ezimopatie. Qui, forniamo metodi dettagliati per isolare le cellule B umane primarie dalle cellule mononucleari del sangue periferico (PBBC) e attivare / espandere cellule B isolate in vitro. Dimostriamo quindi i passaggi necessari per l'utilizzo del sistema CRISPR/Cas9 per ko site-specific di geni endogeni nelle cellule B. Questo metodo consente un KO efficiente di vari geni, che può essere utilizzato per studiare le funzioni biologiche dei geni di interesse. Vengono quindi dimostrati i passaggi per l'utilizzo del sistema CRISPR/Cas9 insieme a un vettore ricombinante, adeno-associato, virale (rAAV) per un'efficiente integrazione site-specific di una cassetta di espressione transgena nelle celle B. Insieme, questo protocollo fornisce una piattaforma ingegneristica passo-passo che può essere utilizzata nelle cellule B umane primarie per studiare le funzioni biologiche dei geni e per lo sviluppo di terapie a cellule B.

Il protocollo aggiornato di espansione e attivazione ha permesso la rapida espansione delle cellule B fino a 44 volte in 7 giorni(figura 1;n =3 donatori). Nell'esperimento KO, il conteggio delle cellule B utilizzando la colorazione blu di Trypan ha mostrato più dell'80% di cellule vitali con una leggera riduzione del recupero cellulare sia nel controllo che nei campioni CD19 KO a 24 ore dopo l'elettroporazione(figura 2A; p ≥ 0,05, n = 3 donatori). Questo risu...

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Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

Qui forniamo un protocollo dettagliato passo-passo per l'ingegneria del genoma basata su CRISPR / Cas9 delle cellule B umane primarie per knockout genico (KO) e knock-in (KI) per studiare le funzioni biologiche dei geni nelle cellule B e lo sviluppo di terapie a cellule B.

Ingegneria genomica delle cellule B umane primarie utilizzando CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

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Research

JoVE Journal

Biology

6.1K Views.  University of Minnesota. Qui forniamo un protocollo dettagliato passo-passo per l'ingegneria del genoma basata su CRISPR / Cas9 delle cellule B umane primarie per knockout genico (KO) e knock-in (KI) per studiare le funzioni biologiche dei geni nelle cellule B e lo sviluppo di terapie a cellule B.

Video: Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to generate RNA-guided nucleases, such as CRISPR-associated (Cas) 9 for site-specific eukaryotic genome editing. Genome engineering by Cas9 is used to efficiently, easily and robustly modify endogenous genes in many biomedically-relevant mammalian cell lines and organisms. Here we show an example of how to utilize the CRISPR/Cas9 methodology to understand the biological function of specific genetic mutations. We model calreticulin (CALR) mutations in murine interleukin-3 (mIL-3) dependent pro-B (Ba/F3) cells by delivery of single guide RNAs (sgRNAs) targeting the endogenous Calr locus in the specific region where insertion and/or deletion (indel) CALR mutations occur in patients with myeloproliferative neoplasms (MPN), a type of blood cancer. The sgRNAs create double strand breaks (DSBs) in the targeted region that are repaired by non-homologous end joining (NHEJ) to give indels of various sizes. We then employ the standard Ba/F3 cellular transformation assay to understand the effect of physiological level expression of Calr mutations on hematopoietic cellular transformation. This approach can be applied to other genes to study their biological function in various mammalian cell lines.

Targeted gene editing using CRISPR/Cas9 has greatly facilitated the understanding of the biological functions of genes. Here, we utilize the CRISPR/Cas9 methodology to model calreticulin mutations in cytokine-dependent hematopoietic cells in order to study their oncogenic activity.

Utilizzando CRISPR/Cas9 Gene Editing per studiare l'attività oncogena di calreticulina mutante in cellule ematopoietiche Cytokine dipendente

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. Complete gene ablation in HSCs required the generation of knockout mice from which HSCs could be isolated, and gene ablation in primary human HSCs was not possible. Viral transduction could be used for knock-down approaches, but these suffered from variable efficacy. In general, genetic manipulation of human and mouse hematopoietic cells was hampered by low efficiencies and extensive time and cost commitments. Recently, CRISPR/Cas9 has dramatically expanded the ability to engineer the DNA of mammalian cells. However, the application of CRISPR/Cas9 to hematopoietic cells has been challenging, mainly due to their low transfection efficiencies, the toxicity of plasmid-based approaches and the slow turnaround time of virus-based protocols.
A rapid method to perform CRISPR/Cas9-mediated gene editing in murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with knockout efficiencies of up to 90% is provided in this article. This approach utilizes a ribonucleoprotein (RNP) delivery strategy with a streamlined three-day workflow. The use of Cas9-sgRNA RNP allows for a hit-and-run approach, introducing no exogenous DNA sequences in the genome of edited cells and reducing off-target effects. The RNP-based method is fast and straightforward: it does not require cloning of sgRNAs, virus preparation or specific sgRNA chemical modification. With this protocol, scientists should be able to successfully generate knockouts of a gene of interest in primary hematopoietic cells within a week, including downtimes for oligonucleotide synthesis. This approach will allow a much broader group of users to adapt this protocol for their needs.

A protocol for fast CRISPR/Cas9-mediated gene disruption in mouse and human primary hematopoietic cells is described in this article. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins are introduced via electroporation with sgRNAs generated through in vitro transcription and commercial Cas9. High editing efficiencies are achieved with limited time and financial cost.

Rottura del Gene altamente efficiente di cellule progenitrici ematopoietiche Murine ed umane di CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Genetica

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been successfully repurposed for genome engineering in many different living organisms. Most commonly, the wildtype CRISPR associated 9 (Cas9) or Cas12a endonuclease is used to cleave specific sites in the genome, after which the DNA double-stranded break is repaired via the non-homologous end joining (NHEJ) pathway or the homology-directed repair (HDR) pathway depending on whether a donor template is absent or present respectively. To date, CRISPR systems from different bacterial species have been shown to be capable of performing genome editing in mammalian cells. However, despite the apparent simplicity of the technology, multiple design parameters need to be considered, which often leave users perplexed about how best to carry out their genome editing experiments. Here, we describe a complete workflow from experimental design to identification of cell clones that carry desired DNA modifications, with the goal of facilitating successful execution of genome editing experiments in mammalian cell lines. We highlight key considerations for users to take note of, including the choice of CRISPR system, the spacer length, and the design of a single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor template. We envision that this workflow will be useful for gene knockout studies, disease modeling efforts, or the generation of reporter cell lines.

CRISPR-Cas is a powerful technology to engineer the complex genomes of plants and animals. Here, we detail a protocol to efficiently edit the human genome using different Cas endonucleases. We highlight important considerations and design parameters to optimize editing efficiency.

Modifica di genoma in linee cellulari di mammifero usando CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

Generazione di modifiche genomiche definite utilizzando CRISPR-CAS9 nelle cellule staminali pluripotenti umane

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Una guida alla distruzione genica precisa nei macrofagi primari derivati dal midollo osseo

High-Efficiency Gene Disruption in Primary Bone Marrow-Derived Macrophages Using Electroporated Cas9-sgRNA Complexes

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) from mice are a key tool for studying the complex biology of tissue macrophages. As primary cells, they model the physiology of macrophages in vivo more closely than immortalized macrophage cell lines and can be derived from mice already carrying defined genetic changes. However, disrupting gene function in BMDMs remains technically challenging. Here, we provide a protocol for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in BMDMs, which allows for the introduction of small insertions and deletions (indels) that result in frameshift mutations that disrupt gene function. The protocol describes how to synthesize single-guide RNAs (sgRNA-Cas9) and form purified sgRNA-Cas9 ribonucleoprotein complexes (RNPs) that can be delivered by electroporation. It also provides an efficient method for monitoring editing efficiency using routine Sanger sequencing and a freely available online analysis program. The protocol can be performed within 1 week and does not require plasmid construction; it typically results in 85% to 95% editing efficiency.

Autore in primo piano: Editing efficiente del genoma CRISPR/Cas9 nei macrofagi derivati dal midollo osseo per una precisa distruzione genica

This protocol describes the procedure for genome editing in mouse bone marrow-derived macrophages using Cas9-sgRNA ribonucleoprotein complexes assembled in vitro and delivered by electroporation.

Distruzione genica ad alta efficienza nei macrofagi primari derivati dal midollo osseo utilizzando complessi elettroporati Cas9-sgRNA

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) from mice are a key tool for studying the complex biology of tissue macrophages. As primary cells, they model the ...

Engineering Oncogenic Heterozygous Gain-of-Function Mutations in Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Throughout their lifetime, hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) acquire somatic mutations. Some of these mutations alter HSPC functional properties such as proliferation and differentiation, thereby promoting the development of hematologic malignancies. Efficient and precise genetic manipulation of HSPCs is required to model, characterize, and better understand the functional consequences of recurrent somatic mutations. Mutations can have a deleterious effect on a gene and result in loss-of-function (LOF) or, in stark contrast, may enhance function or even lead to novel characteristics of a particular gene, termed gain-of-function (GOF). In contrast to LOF mutations, GOF mutations almost exclusively occur in a heterozygous fashion. Current genome-editing protocols do not allow for the selective targeting of individual alleles, hampering the ability to model heterozygous GOF mutations. Here, we provide a detailed protocol on how to engineer heterozygous GOF hotspot mutations in human HSPCs by combining CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair and recombinant AAV6 technology for efficient DNA donor template transfer. Importantly, this strategy makes use of a dual fluorescent reporter system to allow for the tracking and purification of successfully heterozygously edited HSPCs. This strategy can be employed to precisely investigate how GOF mutations affect HSPC function and their progression toward hematological malignancies.

Novel strategies to faithfully model somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) are necessary to better study hematopoietic stem cell biology and hematological malignancies. Here, a protocol to model heterozygous gain-of-function mutations in HSPCs by combining the use of CRISPR/Cas9 and dual rAAV donor transduction is described.

Ingegnerizzazione di mutazioni oncogeniche eterozigoti con guadagno di funzione in cellule staminali e progenitrici ematopoietiche umane

Throughout their lifetime, hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) acquire somatic mutations. Some of these mutations alter HSPC functional ...

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging in primary NK cells. For example, transgene delivery using lentiviral or retroviral transduction resulted in a limited yield of genetically-engineered NK cells due to substantial procedure-associated NK cell apoptosis. We describe here a DNA-free method for genome editing of human primary and expanded NK cells using Cas9 ribonucleoprotein complexes (Cas9/RNPs). This method allowed efficient knockout of the TGFBR2 and HPRT1 genes in NK cells. RT-PCR data showed a significant decrease in gene expression level, and a cytotoxicity assay of a representative cell product suggested that the RNP-modified NK cells became less sensitive to TGF&#946;. Genetically modified cells could be expanded post-electroporation by stimulation with irradiated mbIL21-expressing feeder cells.

Here, we present a protocol to genetically modify primary or expanded human natural killer (NK) cells using Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). By using this protocol, we generated human NK cells deficient for transforming growth factor&#8211;b receptor 2 (TGFBR2) and hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).

Generazione di cellule Knock-out NK umano primario ed espansa utilizzando Cas9 ribonucleoproteine

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

Immunologia e infezioni

Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with hematological malignancies and are currently being investigated for various solid tumors. CAR-T cells are generated by removing T cells from a patient's blood and engineering them to express a synthetic immune receptor that redirects the T-cells to recognize and eliminate target tumor cells. Gene editing of CAR-T cells has the potential to improve safety of current CAR-T cell therapies and further increase the efficacy of CAR-T cells. Here, we describe methods for the activation, expansion, and characterization of human CRISPR-engineered CD19 directed CAR-T cells. This comprises transduction of the CAR lentiviral vector and use of single guide RNA (sgRNA) and Cas9 endonuclease to target genes of interest in T cells. The methods described in this protocol can be universally applied to other CAR constructs and target genes beyond the ones used for this study. Furthermore, this protocol discusses strategies for gRNA design, lead gRNA selection and target gene knockout validation to reproducibly achieve high-efficiency, multiplex CRISPR-Cas9 engineering of clinical grade human T cells.

Here, we present a protocol for gene editing in primary human T cells using CRISPR Cas Technology to modify CAR-T cells.

Ingegneria genomica delle cellule B umane primarie utilizzando CRISPR/Cas9

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Utilizzando CRISPR/Cas9 Gene Editing per studiare l'attività oncogena di calreticulina mutante in cellule ematopoietiche Cytokine dipendente

Rottura del Gene altamente efficiente di cellule progenitrici ematopoietiche Murine ed umane di CRISPR/Cas9

Modifica di genoma in linee cellulari di mammifero usando CRISPR-Cas

Generazione di modifiche genomiche definite utilizzando CRISPR-CAS9 nelle cellule staminali pluripotenti umane

Distruzione genica ad alta efficienza nei macrofagi primari derivati dal midollo osseo utilizzando complessi elettroporati Cas9-sgRNA

Distruzione genica ad alta efficienza nei macrofagi primari derivati dal midollo osseo utilizzando complessi elettroporati Cas9-sgRNA

Distruzione genica ad alta efficienza nei macrofagi primari derivati dal midollo osseo utilizzando complessi elettroporati Cas9-sgRNA

Ingegnerizzazione di mutazioni oncogeniche eterozigoti con guadagno di funzione in cellule staminali e progenitrici ematopoietiche umane

Generazione di cellule Knock-out NK umano primario ed espansa utilizzando Cas9 ribonucleoproteine

Produzione di cellule CAR-T umane ingegnerizzate CRISPR