Questo protocollo utilizza CRISPR-Cas9 per creare linee knock-out o knock-in. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è semplice ed efficiente da seguire soprattutto per i ricercatori alle prime armi. Per il passaging cellulare, trattare le cellule coltivate durante la notte con due millilitri dello 0,25% di EDTA di tripina per piastra a 37 gradi Celsius per due minuti.
Quando le cellule si sono alzate dai fondi della piastra, neutralizzare la reazione enzimatica con due millilitri di terreno di coltura cellulare e trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico. Raccogliere le cellule per centrifugazione e rimosogliere il pellet in cinque millilitri di mezzo di coltura cellulare fresco per il conteggio. Quindi semina 1,8 volte 10 alla quinta parte delle cellule in un pozzo di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzi per la coltura notturna a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.
Per la trasfezione delle cellule, aggiungere un volume appropriato di miscela di trasfezione contenente l'appropriata concentrazione di plasmide CRISPR al volume appropriato di reagente di trasfezione, secondo il progetto sperimentale e le istruzioni del produttore. Dopo aver incubato il mix di trasfezione a temperatura ambiente per il periodo di tempo consigliato, aggiungere la soluzione alle cellule in modo drop-wise. Quindi ruotare delicatamente la piastra per mescolare e posizionare la piastra in un incubatore umidificato di 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica.
Al termine della trasfezione, aggiungere 150 microlitri di tripside-EDTA per dissociare le cellule come appena dimostrato e raccogliere le cellule staccate per centrifugazione. Risospendare il pellet nel siero bovino fetale al 2% in PBS e filtrare le cellule attraverso un colino a rete da 30 micrometri in uno smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza a cinque millilitri o in un tubo FACS. Quindi utilizzare le cellule non trasfette per impostare un cancello di controllo negativo sul citometro di flusso e ordinare le cellule trasfette in base al marcatore fluorescente sul plasmide CRISPR utilizzato per la trasfezione in un tubo contenente 100 microlitri di terreno di coltura cellulare.
Una volta raccolte tutte le cellule trasfette, pellet le cellule mediante centrifugazione alla massima velocità e rimorsi il pellet in 300 microlitri di mezzo di coltura cellulare. Semina 200 microlitri di cellule in un pozzo di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzi e consente alle cellule di riprendersi per alcuni giorni in un'incubatrice di 37 gradi Celsius. Pellet i restanti 100 microlitri di cellule smistate alla massima velocità per cinque minuti ed estrarre il DNA genomico dal pellet risultante secondo protocolli standard di estrazione del DNA.
Successivamente, aggiungere 10 microlitri di tampone di reazione a catena della polimerasi, un microlitro di miscela di deossinucleotide, 2,5 microlitri di primer inverso definito dall'utente, 0,5 microlitri di DNA polimerasi, da due a cinque microlitri del modello di DNA genomico estratto e abbastanza acqua doppia distillata per portare la reazione a un volume finale di 50 microlitri. Eseguire la miscela su un ciclore termico e risolvere la reazione su un gel di agarosio al 2% utilizzando un buffer TAE 1X secondo protocolli standard. Utilizzare un bisturi pulito e affilato per asportare la catena della polimerasi reagire prodotto e purificare il DNA utilizzando un kit di estrazione del gel secondo le istruzioni del produttore.
Misurare la concentrazione del prodotto utilizzando uno spettrofotometro ad assorbanza di 260 nanometri. Preparare una miscela di test contenente 200 nanogrammi del DNA isolato, due microlitri di tampone di reazione di Endonucleasi I T7 e abbastanza acqua doppia distillata per portare il volume finale della miscela a 19 microlitri. Reanneal il prodotto di reazione a catena della polimerasi in un ciclore termico ai parametri indicati e mescolare cinque unità di Endonucleasi I T7 con il prodotto rinnealizzato per un'incubazione di 50 minuti a 37 gradi Celsius.
Al termine dell'incubazione, risolvere il DNA digerito su un gel di agarosio al 2,5% utilizzando un tampone TAE 1X e imageare il gel su un appropriato sistema di imaging in gel. Aprite l'immagine gel in ImageJ e disegnate una casella rettangolare attorno alla banda il più vicino possibile al suo limite. Fate clic su Analizza (Analyze) e impostate misurazioni (Set Measurements), a conferma dell'area, del valore grigio medio e delle opzioni di densità integrate.
Fare clic su OK e selezionare Analizza e Misura. Il valore medio, o densità di intensità grezza, è indicativo dell'intensità della banda. Quando le cellule trasfette da coltura iniziano a diventare confluenti, staccarle con tripina-EDTA, come dimostrato, e seminare le cellule in modo sparso in un piatto di coltura tissutale di 100 millimetri per consentire alle singole colonie di crescere prima di restituire le cellule all'incubatore di coltura cellulare.
Quando le colonie iniziano a formarsi, usa un microscopio con un ingrandimento di quattro X per raccogliere le singole colonie per il trasferimento in singoli pozzi di una piastra da 24 porri contenente 500 microlitri di mezzo di coltura cellulare per pozzo. Fai attenzione che il tuo consiglio non tocchi le colonie circostanti per evitare la miscelazione di colonie all'interno di singoli pozzi o scegli da un'area di scarsa crescita della colonia. Quando tutti i cloni sono stati raccolti, posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare fino a quando le colture diventano confluenti.
Poiché i plasmidi non digeriti sono super-arrotolato, tendono a funzionare più velocemente delle loro controparti linearizzate. Per determinare se gli oligonucleotidi sono stati clonati con successo nella spina dorsale plasmide CRISPR, viene eseguita la PCR della colonia e i cloni positivi vengono inoculati prima che i plasmidi siano estratti e inviati per il sequenziamento sanger. Il segnale fluorescente può essere facilmente visualizzato al microscopio dopo una consegna riuscita dei plasmidi, permettendo alle cellule trasfette di essere ordinate per citometria a flusso.
Viene eseguito un saggio di endonucleasi I T7 per verificare l'efficienza di scissione del DNA genomico, calcolata dalle intensità delle bande osservate su un gel di agarosio. Inoltre, se un esperimento basato sulla riparazione diretto dall'omologia è progettato per incorporare un sito di restrizione nel locus bersaglio, un saggio di polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione può essere eseguito con un corrispondente enzima di restrizione. Per convalidare ulteriormente che un gene codificante proteico sia stato inattivato con successo, è possibile eseguire una macchia occidentale per garantire che non sia presente alcuna proteina mirata.
Lo smistamento delle cellule dopo la trasfezione elimina le cellule senza plasmidi incorporati, aumentando così la percentuale di cellule schermate nelle fasi successive come aventi un gene knock-out o knock-in. Con lo sviluppo di questa tecnica, siamo ora in grado di produrre linee cellulari knock-out per studiare la funzione genica e le linee cellulari knock-in per modellare malattie specifiche per comprenderne il meccanismo.
