Il protocollo combina l'isolamento specifico per età di colture miste spontanee derivate da cellule staminali neurali contenenti cellule precursori e astrociti oligodendrocitari differenzianti, saggi che imitano condizioni patologiche e letture robuste e ad alto contenuto. Queste caratteristiche permettono di studiare in modo differenziato la mielinizzazione evolutiva e la rimielinizzazione adulta in condizioni fisiologiche e patologiche e in un microambiente che prende in considerazione l'apporto degli astrociti. Per l'isolamento delle cellule staminali neurali dai proencefali fetali del giorno embrionale 13,5 a 14,5, posizionare le teste degli embrioni in una capsula di Petri pulita con PBS ghiacciato e utilizzare una pinza per rimuovere la pelle dal cranio sotto ingrandimento.
Una volta che il cervello è visibile e ripulito dalla pelle, utilizzare una pinza per spremere il cervello dal cranio e rimuovere il cervelletto. Utilizzare la pinza per rimuovere le meningi e posizionare il tessuto isolato nel tampone di dissociazione non enzimatico. Quando tutto il tessuto cerebrale è stato isolato, estrarre da due a tre campioni in 150 microlitri di tampone di dissociazione non enzimatico per tubo da 1,5 millilitri e incubare i tubi per 15 minuti a 37 gradi Celsius con agitazione continua.
Alla fine dell'incubazione, aggiungere 850 microlitri di mezzo standard a ciascun tubo e pipetta per mescolare fino a quando la sospensione non è priva di grumi. Se il tessuto non dissociato è ancora visibile, lasciare riposare i campioni per due minuti per consentire ai tessuti di depositarsi sul fondo dei tubi. Quando la dissociazione è completa, le cellule piatte ad una densità da 10 a 50 cellule per microlitro in 10-30 millilitri di concentrazione del mezzo della neurosfera in un pallone T25 o T45 e posizionare il pallone nell'incubatore di colture cellulari in posizione verticale per impedire l'attaccamento cellulare.
da topi adulti di 2,5 mesi, posizionare cervelli da quattro a cinque topi adulti in un tubo da 50 millilitri di HBSS ghiacciato e posizionare un cervello, lato ventrale verso il basso, nella direzione rostrale-caudale su un pallone sterile coperto di foglio di alluminio riempito con meno 20 gradi Celsius durante la notte-acqua fredda. Usa una lama di rasoio per rimuovere i bulbi olfattivi e per tagliare due o tre fette coronali spesse un millimetro dalla corteccia al chiasma ottico. Posizionare le fette sulla superficie fredda in posizione ventro-dorsale e identificare il corpo calloso e i due ventricoli laterali.
Usando l'ingrandimento, isolare le pareti dei ventricoli laterali, facendo attenzione a non includere pezzi del corpo calloso, e posizionare il tessuto isolato in cinque a 10 millilitri di tampone di dissociazione enzimatica per un'incubazione di 15 minuti a 37 gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, pipettare i tessuti almeno 50 volte prima di incubare i campioni a 37 gradi Celsius per altri 10 minuti. Al termine dell'incubazione, neutralizzare la tripsina con cinque millilitri di terreno di coltura standard e filtrare la sospensione tissutale attraverso un filtro da 70 micron.
Centrifugare la soluzione filtrata per cinque minuti a 400 volte g e sospendere nuovamente il pellet in soluzione di saccarosio per una seconda centrifugazione. Al termine della centrifugazione, sospendere nuovamente il pellet in una soluzione di lavaggio di albumina sierica bovina per un'altra centrifugazione, quindi sospendere nuovamente il pellet nel terreno di coltura standard per il conteggio e placcare le cellule in un pallone verticale T-25 o T-45. Per la differenziazione primaria della neurosfera, aggiungere fibroblasti di base e fattori di crescita endoteliali alla coltura di cellule staminali neurali ogni due giorni.
Quando le neurosfere raggiungono un diametro da 100 a 500 micron, passano le cellule per dissociazione meccanica secondo protocolli standard. Per la differenziazione dell'oligosfera, trattare le cellule con il fattore di crescita dei fibroblasti di base nel fattore AA derivato dalle piastrine ogni due giorni. Quando le oligosfere raggiungono un diametro da 100 a 150 micron, dissociano le sfere per dissociazione meccanica secondo protocolli standard e seminano la sospensione cellulare a una densità di 3000 cellule per centimetro quadrato su piastre rivestite di laminina poli-DL-ornitina.
Dopo tre giorni, sostituire il surnatante di ciascuna coltura con lo stesso volume di mezzo di differenziazione degli oligodendrociti. Per eseguire un'induzione del blocco di differenziazione mediata dall'infiammazione, dopo la dissociazione delle neurosfere e durante la produzione di oligosfere, aggiungere il mix di citochine di interesse al terreno di coltura. Per indurre la morte cellulare per privazione di ossigeno-glucosio, due giorni dopo la semina nelle piastre multi-pozzo, trasferire il surnatante da ogni coltura in singoli pozzetti di una piastra multi-pozzo.
Aggiungere metà del volume di mezzo OGD ai pozzetti e trasferire le colture in una camera di ipossia ermetica satura del 95% di azoto e del 5% di anidride carbonica. Posizionare la camera nell'incubatore di colture cellulari. Dopo tre ore, sostituire il mezzo nelle camere con il mezzo separato dalla piastra di coltura multi-pozzo.
Dopo aver verificato la qualità della colorazione cellulare, nel menu Acquisizione del software di screening ad alto contenuto, selezionare Tempo di esposizione fisso e Mini scansione e selezionare 10 campi per pozzetto e due pozzetti per condizione sperimentale per consentire di impostare i parametri di analisi nel sottoinsieme di campi per l'intera piastra. Segui il flusso di lavoro passo dopo passo per sviluppare l'intero algoritmo. Selezionare Elabora immagine per ogni canale e fare clic su Rimozione sfondo per selezionare il livello di segnale desiderato.
Per identificare e selezionare i nuclei mediante colorazione nucleare, fare clic su Identifica oggetto primario, regolare la soglia per identificare i singoli nuclei e fare clic su Convalida oggetti primari per impostare le soglie in base alle aree e alla posizione degli oggetti. Fare clic su Identifica punti per ciascun canale corrispondente ai marcatori di lignaggio specifici e impostare la larghezza del valore dell'anello su tre e la distanza da zero per consentire l'identificazione della fluorescenza citoplasmatica. Selezionare i livelli di riferimento nel flusso di lavoro per costruire l'analisi e consentire il conteggio automatico dei nuclei condensati in base alla dimensione nucleare e all'intensità della colorazione nucleare e delle specifiche cellule marker-positive in base alla fluorescenza citoplasmatica identificata dall'anello, quindi fare clic su Riproduci.
Durante la prima fase della coltura, le cellule staminali neurali mantengono la loro espressione di nestina. La maggior parte delle cellule sono anche NG2-positive. Le cellule CNPasi-positive corrispondenti allo stadio pre-oligodendrocitario sono rilevabili da tre a sei giorni dopo l'induzione della differenziazione mediata da T3, mentre gli oligodendrociti maturi MBP-positivi appaiono in una percentuale significativa dopo sei-12 giorni in vitro.
L'analisi di screening ad alto contenuto consente il rilevamento di singole cellule all'interno della coltura attraverso la colorazione nucleare e l'analisi dell'intensità di fluorescenza. La composizione della coltura alla fine della fase di differenziazione differisce a seconda che le colture siano di origine fetale o adulta, con colture fetali più reattive al differenziamento mediato da T3 e che raggiungono una percentuale più elevata di oligodendrociti maturi. Si noti che quando le cellule precursori degli oligodendrociti derivate dalle cellule staminali neurali vengono seminate ad alta densità, si aggregano e gli astrociti replicanti producono rapidamente uno strato cellulare confluente, impedendo l'osservazione della caratteristica forma a rete di ragno degli oligodendrociti maturi.
Il blocco della differenziazione mediato dall'infiammazione induce una forte diminuzione degli oligodendrociti pre e maturi, come rilevato dalla colorazione CNPasi e MBP in entrambe le colture fetali e adulte. Un aumento del numero di cellule precursori degli oligodendrociti si verifica anche nelle colture adulte trattate con citochine. Mentre le cellule precursori degli oligodendrociti fetali e adulte mostrano lo stesso all'esposizione infiammatoria alle citochine, solo le colture di derivazione fetale sono sensibili alla tossicità della privazione di ossigeno-glucosio.
Il metodo può essere implementato con qualsiasi tipo di cellule precursori degli oligodendrociti, processo interferente di differenziazione e maturazione, per testare nuove strategie volte a combattere le malattie che colpiscono la mielinizzazione o la rimielinizzazione
