Il sistema bipartito GAL4-UAS è uno strumento versatile per l'analisi genetica funzionale in Anopheles gambiae attraverso la modificazione genetica dell'espressione genica in modo controllato spaziotemporale. Il sistema binario consente flessibilità negli approcci sperimentali per la caratterizzazione fenotipica dell'espressione transgenica anche se sono indotti gravi costi di fitness. Questo sistema può essere utilizzato per la caratterizzazione fenotipica di geni potenzialmente coinvolti nella resistenza agli insetticidi, nella trasmissione di agenti patogeni o in quelli che hanno usi nei metodi di controllo genetico.
Fraser Coleman, un tecnico di ricerca, aiuterà a dimostrare questa procedura Inizia raccogliendo le pupe usando un pipetto Pasteur di plastica da tre millilitri con l'estremità tagliata su un piatto piatto trasparente adatto per l'uso con uno stereomicroscopio. Rimuovere con attenzione la maggior parte dell'acqua intorno alle pupe. Accendi la lampadina fluorescente e lasciala riscaldare.
Considerare i modelli spaziotemporali di colore di un'espressione e il rapporto di diversi fenotipi che ci si aspetta quando si esegue lo screening per il marcatore fluorescente. Selezionare il filtro richiesto sullo stereoscopio a fluorescenza e verificare che sia visibile un fascio di luce colorato diretto al centro della piastra del palco. Sotto la luce bianca, centra le pupe nel campo visivo e mettile a fuoco.
Spegni la luce bianca e usa la messa a fuoco fine per mettere a fuoco l'area delle pupe che trasportano il fenotipo di interesse con un motivo fluorescente visibile. Utilizzare un pennello dettagliato per ruotare delicatamente le pupe e spostare le pagaie anali in modo che i genitali esterni possano essere identificati. Pupe separate basate su genitali esterni distintivi.
I maschi hanno un lungo tubo che estrude dal segmento dorsale finale circa la metà della lunghezza delle pagaie anali. I genitali esterni delle pupe femminili sono considerevolmente più corti e biforcati. Separare le pupe sessuate in gruppi di 10 o meno in tubi trasparenti da 20 millilitri con acqua e sigillare i tubi con un batuffolo di cotone idrofilo.
Aspirare il numero desiderato di adulti maschi e femmine dai tubi in una gabbia o in un piccolo secchio, facendo attenzione a non danneggiare gli adulti durante questo trasferimento. Mantenere la croce per cinque o sette giorni prima di nutrirsi con il sangue. Il giorno seguente, le uova possono essere raccolte per studiare lo sviluppo dell'embrione.
Assemblare la camera di ovodeposizione e introdurre con cura da 10 a 15 femmine alimentate con sangue in essa. Coprire la camera di ovodeposizione e lasciare agire per 20 minuti. Staccare con cura il tubo di polipropilene da 50 millilitri dal vaso di ovodeposizione, assicurandosi di non rilasciare le zanzare.
Coprire la pentola e lasciare che le uova maturino fino alla fase di sviluppo di interesse. Raccogli le uova dalla pentola usando un pennello finemente dettagliato e mettile sull'acqua in un blocco di vetro scavato di 40 millimetri quadrati. Rimuovere con cura l'acqua dal mattone di vetro con una micropipetta e coprire le uova in 500 microlitri di FAA.
Oscillare delicatamente sullo shaker orbitale a temperatura ambiente per 30 minuti. Risciacquare accuratamente le uova 15 volte con acqua distillata per rimuovere tutte le tracce di soluzione FAA. Utilizzando una micropipetta da 1000 microlitri aggiungere e quindi rimuovere un millilitro di acqua distillata alla volta facendo attenzione a non danneggiare le uova mentre lo si fa.
Coprire le uova fisse con un millilitro di soluzione di Trpis e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Le uova inizieranno a sviluppare chiazze pallide dopo cinque minuti di incubazione raggiungendo infine un colore bianco latte una volta eliminato. Risciacquare accuratamente le uova 15 volte con acqua distillata per rimuovere tutte le tracce di soluzione di Trpis.
L'espressione di marcatori fluorescenti guidati dal promotore 3xP3 è osservata negli occhi e nei gangli ventrali delle pupe di Anopheles gambiae. L'utilizzo di diversi marcatori fluorescenti colorati consente la selezione e lo screening di individui modificati che trasportano diversi componenti GAL4 e UAS. Quando si lavora con un sistema BIPARTITO GAL4-UAS, è necessario incrociare maschi e femmine di ceppi diversi per acquisire progenie che trasporta sia i componenti GAL4 che UAS.
La morfologia differenziale osservata nel genitale esterno maschile e femminile delle pupe viene utilizzata per il sexing. Un esempio di pupe non identificabili è evidenziato qui. La rimozione di tutta l'acqua dalle pupe, come mostrato a destra, aumenta la difficoltà di sexing poiché le pagaie anali oscurano la visualizzazione dei genitali.
Il sistema bipartito GAL4-UAS consente la modifica dell'espressione genica in modo spaziotemporale controllato. Questo può essere visualizzato incrociando l'enocita e l'onnipresente GAL4 quattro linee di guida che esprimono con la linea di risposta UAS-mCherry. Un vantaggio chiave dell'utilizzo di un sistema BIPARTITO GAL4-UAS è la facilità di studiare fenotipi letali anche nella fase embrionale.
Per fare questo, è necessario visualizzare la morfologia interna degli embrioni. Le normali caratteristiche morfologiche osservate nelle diverse fasi dello sviluppo embrionale a 12, 24 e 36 ore dopo la deposizione possono essere osservate dopo il completamento del protocollo di compensazione degli embrioni. È fondamentale durante questa procedura che pupe e uova non siano autorizzate a seccare.
Pertanto, è importante lavorare rapidamente quando si rimuovono i liquidi. Il metodo GAL4-UAS ci ha permesso di caratterizzare funzionalmente i geni coinvolti nella resistenza agli insetticidi e quelli con potenziali usi nei metodi di controllo del gene drive.
