La ricerca sulla biologia dei macrofagi umani è stata limitata perché si basa sulla raccolta di cellule dai donatori. Questo protocollo mostra un metodo in cui possiamo produrre macrofagi umani da cellule staminali pluripotenti in laboratorio. Questo è un protocollo robusto che può essere scalato per produrre macrofagi in grandi quantità per terapie cellulari o ricerca.
Le cellule staminali pluripotenti possono essere manipolate geneticamente. Quindi in questo protocollo, possiamo generare macrofagi con un fenotipo specifico, tag fluorescenti e anche macrofagi per modellare gli stati delle malattie. La dimostrazione visiva di questo protocollo è utile perché l'uso dello strumento di passaggio facile non sarà familiare a molti ricercatori.
Inoltre, il livello di cura necessario per reintegrare i media e raccogliere le cellule è difficile da dire a parole. Quando le cellule coltivate hanno raggiunto l'80% di confluenza, sostituire il mezzo di coltura trascorso con 1,5 millilitri di mezzo fresco. Tenendo il recipiente di coltura in una mano, arrotolare uno strumento di passatura delle cellule usa e getta attraverso la piastra in una direzione.
Tutte le lame nel rullo devono toccare la piastra. Mantenere una pressione uniforme durante il rotolamento. Ripetere il rotolamento nella stessa direzione fino a quando l'intero pozzo non è stato coperto.
Ruotare il contenitore di coltura di 90 gradi e ripetere il rotolamento. Con una pipetta sterile, utilizzare i mezzi nel pozzo per spodedare le colonie tagliate. Aspirare CELLstart e sostituire i supporti.
Trasferire le celle con un rapporto uno a quattro su pozzi pre-rivestiti preparati come descritto nel manoscritto. Per iniziare il processo di differenziazione il giorno zero, aggiungere 2,25 millilitri di supporto di fase uno in due pozzetti di una piastra a sei pozzetti di attacco ultra bassa. Quindi, per un pozzo confluente dell'80% di iPSC in una piastra a sei porri, sostituire il supporto di manutenzione con 1,5 millilitri di supporti di primo stadio.
Tagliare le colonie utilizzando un nuovo strumento di passaging cellulare. Utilizzando una pipetta, trasferire le colonie tagliate nei due pozzali della piastra a sei pozza di fissaggio ultra bassa. Il secondo giorno, regolare le concentrazioni di citochine aggiungendo 0,5 millilitri di supporti hESC SFM alla piastra a sei pozzi contenente il giorno due corpi embrioidi.
Il quarto giorno, rivestire quattro pozzali di una piastra di coltura tissutale a sei pozzi con 0,1% di gelatina. Dopo aver incubato per almeno 10 minuti, rimuovere la gelatina e aggiungere 2,5 millilitri di mezzi di secondo stadio. Raccogliere i corpi embrionale formati dai due pozzi di una piastra a sei pozzetti e metterli in un tubo di centrifuga da 50 millilitri.
Permettere loro di depositarsi nella parte inferiore del tubo per gravità. Quindi aspirare attentamente il supporto dal tubo e rimospendare i corpi embrioidi in due millilitri di mezzi di fase due. Trasferire da 10 a 15 corpi embrioidi in un pozzo rivestito di gelatina contenente 2,5 millilitri di mezzi di secondo stadio e incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%.
Per due o tre settimane, cambia i media ogni tre o quattro giorni. La placcatura degli OC è fondamentale. Avere meno di 10 o più di 15 EB o distribuirli in modo non uniforme può portare a basse rese di macrofagi.
Dopo due o tre settimane, i corpi embrionali iniziano a rilasciare cellule ematopoietiche non aderenti in sospensione. Utilizzando un colino di 40 micrometri, raccogliere queste cellule in un tubo da 50 millilitri e quindi reintegrare il supporto. Centrifugare la sospensione delle cellule ematopoietiche a 200 volte g per tre minuti.
Rimescolare le cellule ematopoietiche nei mezzi della terza fase. Quindi placcare le cellule ad una densità di 0,2 per 10 alla sesta parte per millilitro. Cambia il palco tre media ogni cinque giorni.
Dopo nove-11 giorni, i macrofagi saranno completamente differenziati e pienamente funzionanti. Aggiungere otto volte 10 al quarto macrofagi derivato da iPSC in 200 microlitri di supporti di stadio tre a ciascun pozzo di una piastra da 96 porri. Aggiungere 100 microlitri di soluzione di perline a ciascun pozzo contenente macrofagi derivati da iPSC.
Utilizzare un sistema di imaging ad alto contenuto per l'immagine della piastra. Acquisire tre o più campi in ogni pozzo per ottenere una buona rappresentazione. Colonie iPSC, corpi embrionali, cellule sospese ematopoietiche e macrofagi maturi erano morfologicamente distinti.
I macrofagi derivati dall'iPSC erano grandi, avevano singoli piccoli nuclei di forma ovale e avevano abbondante citoplasma contenente molte vescicole. Il fenotipo del macrofago è stato valutato dalla citometria del flusso. I macrofagi maturi derivati dall'iPSC hanno espresso il marcatore di lignaggio CD45 e il marcatore di maturazione del macrofago 25F9 e sono stati negativi per il marcatore di macrofago immaturo monocito CD93.
I macrofagi derivati dall'iPSC esprimevano diversi marcatori mieloidi di lignaggio ed erano positivi per il marcatore di modulazione immunitaria CD86. Una piccola parte dei macrofagi esprimeva recettori delle chemiochine CX3CR1, CCR2, CCR5 e CCR8. La capacità fagocitica iPSC-DM è stata valutata utilizzando bioparticelle e un sistema di imaging ad alto contenuto.
Le bioparticelle non erano fluorescenti se aggiunte alle colture di macrofagi, ma dopo la fagocitosi fluorescenza verde brillante nel pH acido intracellulare. La frazione fagocitica rappresenta la proporzione di macrofagi che le bioparticelle fagocitose e l'indice fagocitico è la misura del numero di bioparticelle che ogni macrofago ha ingerito. I macrofagi possono cambiare fenotipo in risposta a segnali ambientali.
RT-PCR è stato utilizzato per quantificare l'espressione di mRNA upregolato dei geni. I macrofagi trattati con LPS e interferone gamma o IL4 hanno mostrato una percentuale significativamente inferiore di cellule fagocitiche rispetto ai macrofagi ingenui. I macrofagi trattati con IL10 hanno mostrato una maggiore percentuale di cellule fagocitiche e un aumento dell'indice fagocitico.
Questo protocollo potrebbe essere utilizzato per fornire una fonte di cellule preconfezionate per trattare malattie come le malattie croniche del fegato in cui i macrofagi si sono dimostrati terapeutici nei modelli animali. I macrofagi derivati dall'iPSC possono essere utilizzati per studiare macrofagi associati a diversi stati di malattia. Ad esempio, usiamo queste cellule per studiare i macrofagi associati ai tumori nel cancro al seno.
Abbiamo modificato il fenotipo dei macrofagi derivati dall'iPSC mediante programmazione genetica usando un singolo fattore di trascrizione chiamato KLF1. Con questo, abbiamo prodotto macrofagi che sembrano macrofagi dell'isola erythroid e hanno fornito approfondimenti sulla produzione e la maturazione dei globuli rossi.
