Il valore unico di questo protocollo è che due persone che utilizzano attrezzature prontamente disponibili in piccoli spazi di laboratorio possono produrre abbastanza zanzare sterili per supportare un programma SIT operativo di 50 acri. L'efficienza e il basso costo di questa tecnica la rendono accessibile, intrattabile anche per i piccoli distretti di controllo delle zanzare per aumentare il loro programma di controllo vettoriale integrato. A dimostrare la procedura saremo io e Barbara Bayer, tecnici di laboratorio di scienze biologiche dell'unità di ricerca.
Per allevare Aedes aegypti adulto dalle pupe, preparare gabbie di allevamento in alluminio pieghevoli da 60 per 60 per 60 centimetri con uno schermo in rete di fibra di vetro di dimensioni di 0,84 x 0,84 millimetri e un manicotto di calza a portata di mano su una parete verticale di ciascuna gabbia. Posizionare un bicchiere di plastica da 1.900 millilitri con pupe Aedes aegypti in un rapporto di uno a uno in ogni gabbia di allevamento e legare la manica chiusa, lasciando le tazze in gabbie per l'eclosione per circa quattro giorni a 28-30 gradi Celsius superiore al 50% di umidità relativa in un ciclo luce:buio 12:12 o 14:10 fino a quando non emergono più adulti. 24 ore dopo aver posizionato le pupe nelle gabbie di allevamento, posizionare un contenitore di soluzione di saccarosio al 10% con uno stoppino di spugna in ogni gabbia e sospendere una spugna di 10 per 2 centimetri imbevuta di miele da un gancio metallico per fornire rispettivamente idratazione e nutrimento alle zanzare adulte.
Da 48 a 72 ore dopo che la maggior parte degli adulti è emersa ogni due o tre giorni per le successive tre o quattro settimane, riempire il preservativo di pelle di agnello con 50-100 millilitri di sangue bovino defibrinato per gabbia e riscaldare i preservativi a circa 37 gradi Celsius in un bagno di acqua calda. Dopo aver accuratamente tamponato i preservativi con l'asciugamano, posizionare i preservativi parzialmente asciutti in singole piastre di Petri rivestite di carta all'interno delle gabbie per 30-60 minuti. Da 48 a 72 ore dopo ogni poppata di sangue, posizionare una tazza di ovodeposizione da 1.900 millilitri contenente 800 millilitri di acqua di pupa filtrata e fornita con un foglio da 8 a 10 per 30 centimetri di carta per la germinazione dei semi montato a filo lungo la circonferenza interna della tazza in ciascuna gabbia.
Per allevare le larve di Aedes aegypti dalle uova, utilizzare una carta di ovideposizione con 5.000 a 10.000 uova presenti e tagliare una sezione da tre a sette centimetri perpendicolare alla linea di ovideposizione. Mettere il pezzo in un nuovo contenitore da 460 millilitri riempito per metà con acqua di rubinetto e un pizzico di fiocchi di cibo per pesci polverizzati. Coprire e agitare vigorosamente il contenitore per almeno un minuto prima di versare l'intero contenuto in una padella larvale contenente tre litri di acqua di rubinetto e 50 millilitri di liquame marrone.
Contrassegnare la padella con la data di inizio, le informazioni sulla deformazione e il programma di alimentazione. Una volta raggiunta la proporzione approssimativa di larve nelle vasche larvali, versare il contenuto di ciascuna padella attraverso un setaccio da 20 a 40 e utilizzare una bottiglia di acqua di rubinetto per lavare le pupe e le larve dal setaccio in un becher di plastica graduato da tre litri. Per separare le pupe maschili dalle larve e dalle pupe femminili, dividere il contenuto di ciascun becher tra più contenitori di plastica da 1,9 litri e posizionare un contenitore di raccolta rigido da quattro litri poco profondo sotto la chiusa alla base di un separatore di pupale.
Riempire due bicchieri di plastica graduati da tre litri pieni di acqua di rubinetto per circa tre quarti e versare l'acqua attraverso lo spazio tra le lastre di vetro del separatore mentre si regolano le manopole superiore e inferiore per consentire all'acqua di fluire continuamente attraverso il separatore. Una volta che l'acqua stagnante si è raccolta uniformemente ad un'altezza di circa 1,25 centimetri dalla base delle piastre, contrassegnare con del nastro adesivo le posizioni di partenza alle manopole inferiori del separatore e iniziare a versare i contenitori di pupe e larve nel separatore ruotando continuamente le manopole inferiori in senso antiorario da uno a due centimetri dalle posizioni di partenza. Quando la maggior parte o tutte le larve hanno lavato attraverso la chiusa nel contenitore di raccolta, mettere in pausa il flusso d'acqua e utilizzare un setaccio numero 30 per liberare il contenitore di raccolta delle larve.
Quando tutte le larve sono state rimosse, versare l'acqua e regolare nuovamente le manopole per consentire alle pupe maschili di essere lavate nel contenitore di raccolta. Quindi versare le pupe maschili dal contenitore in un setaccio numero 20 e utilizzare una bottiglia da un litro di acqua del rubinetto per lavare le pupe dal setaccio in un contenitore separato da 1,9 litri. Quando tutte le pupe maschili sono state raccolte, versare l'acqua e regolare le manopole per consentire la raccolta delle pupe femminili.
Utilizzando il setaccio numero 20 per trasferire le pupe femmine in un nuovo contenitore da 1,9 litri come appena dimostrato. Quindi versare l'acqua e regolare nuovamente le manopole fino a quando tutte le zanzare immature sono state espulse dal separatore. Filtrare le pupe maschili raccolte con un setaccio e lavare la cacca in un becher graduato da un litro con meno acqua possibile.
Versare con cura le pupe in piastre di Petri rivestite con carta da filtro umida in un unico strato. Rimuovere l'acqua stagnante dal fondo della piastra di Petri usando una pipetta da pascolo fresca da tre millilitri per evitare il movimento della pupa durante il lavoro. Impacchettare le piastre e le pile di Petri prima di sigillarle all'interno di un sacchetto richiudibile etichettato da 3,8 litri per adattarsi alla camera di irradiazione.
Per contrassegnare lotti quantificati di zanzare maschi irradiate adulte, rimuovere qualsiasi fonte di nutrizione dalla gabbia di allevamento e posizionare una gabbia in una grande camera di anidride carbonica per cinque-sette minuti, battendo i lati del contenitore per rimuovere eventuali zanzare aggrappate alle pareti. Alla fine del periodo di esposizione, trasferire le zanzare in una fiala di aspiratore e anestetizzare nuovamente le zanzare prima di scuotere le zanzare in una superficie di lavoro coperta di carta bianca. Aspirare con cura tutti i maschi dal piano di lavoro in una nuova fiala e ripetere le esposizioni e la raccolta fino a quando tutti i maschi adulti sono stati raccolti da tutte le gabbie di allevamento.
Ad un certo punto durante il processo di selezione del sesso, generare una fiala contenente solo 25 zanzare maschi adulti. Quando tutti i maschi sono stati raccolti, pesare ogni vile di zanzare in una barca di pesatura tarata su una bilancia e versare rapidamente le zanzare pesate in un contenitore di cartoncino da 240 millilitri contenente 50 milligrammi di colorante di marcatura. Inclinare e ruotare il contenitore di una rotazione completa in senso orario e antiorario fino a quando tutte le zanzare sono state leggermente rivestite e versare le zanzare in una nuova barca di pesatura, quindi piegare la barca di pesatura a metà per consentire alle zanzare di essere incanalate attraverso la custodia della calza nel contenitore di rilascio.
Quando circa due grammi di zanzare maschi sono stati aggiunti al contenitore di rilascio, legare la manica della stockinette chiusa e contrassegnare il nastro adesivo sulla lunetta del contenitore di rilascio con il colore del colorante, il numero del contenitore e il peso totale delle zanzare. In questo esperimento rappresentativo di allevamento di zanzare Aedes aegypti adulto, irradiazione e marketing, due grammi di zanzare adulte maschi sono stati raccolti da tre gabbie di allevamento e insieme a due fiale di 25 maschi da due gabbie per consentire il calcolo del peso medio per zanzara. 25 femmine sono state scartate in totale da due dei lotti.
L'alimentazione tempestiva e osservativa durante la settimana di allevamento larvale è fondamentale per generare pupe ben sviluppate per la separazione. Ciò genera una chiara distinzione tra maschi e femmine che porta a una bassa presenza di femmine nelle fasi di marcatura. Oltre ad usarli nei programmi SIT operativi, questi maschi sterili possono anche essere ampiamente utilizzati in esperimenti che studiano la competizione di accoppiamento, la sopravvivenza e la dispersione dei maschi irradiati rispetto ai maschi selvatici non irradiati.
La modifica della tecnica per includere le zanzare femmine ci consente di studiare l'impatto del rilascio involontario di femmine irradiate per quanto riguarda la fecondità e la competenza del vettore.
