Questo protocollo misura la competitività dell'accoppiamento delle zanzare maschili, che è un prerequisito per i programmi di soppressione della popolazione di zanzare basati sul rilascio maschile. Questo criterio di idoneità viene valutato come parte del controllo di qualità e della valutazione del ceppo. Questo metodo riduce il tempo sperimentale del 90% e consente il confronto diretto della competitività dell'accoppiamento tra due linee sterili o infette da Wolbachia.
A eseguire questa procedura saranno Irene Li e Keng Wai Mak. Per iniziare, sesso le zanzare maschio e femmina nella fase pupale, in base alle loro differenze di dimensioni. Per ogni serie di zanzare, trasferire 100 pupe maschili in una gabbia pre-etichettata per l'alimentazione del saccarosio o l'alimentazione del saccarosio Rhodamine B.
Metti le pupe femminili in piccoli lotti da 40 a 50 per gabbia. All'emergere degli imagos, controllare le gabbie per la presenza di zanzare maschio. Per preparare la soluzione di saccarosio 0,2% Rhodamine B, sciogliere 200 milligrammi di polvere di Rhodamine B per ogni 100 millilitri di soluzione di saccarosio al 10%.
Mescolare bene per assicurarsi che tutta la polvere sia sciolta. Preparare 20 bottiglie di alimentazione dello zucchero con uno stoppino. Aggiungere 10 millilitri di saccarosio al 10% a 10 flaconi di alimentazione e 10 millilitri di soluzione di saccarosio 0,2% di Rodamina B per gli altri 10 flaconi di alimentazione.
Metti cinque bottiglie di alimentazione in ogni gabbia maschile preparata e lascia che le zanzare maschio si nutrano per tre giorni prima dell'esperimento di accoppiamento. Accendere la lampada del bruciatore a mercurio e lo stereomicroscopio. Lasciare stabilizzare la sorgente luminosa della lampada del bruciatore a mercurio per 10 minuti.
Quindi impostare i filtri di fluorescenza per la proteina di fluorescenza rossa uno. Aspirare un piccolo numero di zanzare alla volta nel tubo di vetro dell'aspiratore orale. Attraverso il tubo di vetro, osserva il corpo delle zanzare maschio sotto lo stereomicroscopio fluorescente.
Utilizzare solo zanzare maschio contrassegnate con Rhodamine B per l'esperimento. Set di trasferimento Un maschio di zanzare in 12 bicchieri di carta fissati con rete. Metti 10 zanzare maschie nutrite con saccarosio per tazza in sei tazze e 10 saccarosio rhodamine B alimentate con zanzare maschio per tazza nelle altre sei tazze.
Ripeti questo passaggio per impostare le zanzare maschio B. Impostare 12 gabbie per il test di accoppiamento. In ciascuna delle sei gabbie, includono 10 zanzare maschio A che sono marcate Rodamina B, 10 zanzare maschio B set non contrassegnate e 10 zanzare femmine vergini selvatiche.
Nelle altre sei gabbie, includono 10 zanzare maschio A set non contrassegnate, 10 zanzare maschio set B marcato Rhodamine B e 10 zanzare femmine vergini selvatiche. Etichettare queste gabbie per distinguere chiaramente tra le due combinazioni di accoppiamento. Metti le rispettive tazze di maschi nelle gabbie di accoppiamento secondo le etichette.
Rimuovere la rete e picchiettare delicatamente la tazza per spingere i maschi fuori dalla tazza. Rimuovere con attenzione il bicchiere di carta e la rete dalla gabbia per assicurarsi che nessuna zanzara fuoriesca dalla gabbia. Lascia che le zanzare maschio si acclimatino nella gabbia di accoppiamento per almeno un'ora.
Usando un aspiratore orale, trasferisci le zanzare femmine vergini selvatiche in 12 bicchieri di carta, ogni tazza contenente 10 zanzare. Dopo il periodo di acclimatazione per le zanzare maschio, trasferire una tazza di femmine in ogni gabbia di accoppiamento e rimuovere la rete. Spingere delicatamente la tazza per incoraggiare le zanzare femmine rimanenti fuori dalla tazza, quindi rimuovere con cura il bicchiere di carta e la rete dalla gabbia per assicurarsi che nessuna zanzara fuoriesca dalla gabbia.
Lasciare che l'accoppiamento avvenga per tre ore, quindi terminare l'esperimento di accoppiamento rimuovendo tutte le zanzare da ogni gabbia con un aspiratore meccanico. Anestetizzare a freddo le zanzare sul ghiaccio per almeno cinque minuti. Quando le zanzare sono completamente anestetizzate, raccogliere delicatamente le zanzare femmine e ospitarle in un bicchiere di carta separato fissato con una rete.
Etichettare il bicchiere di carta trasferendo la rispettiva etichetta dalla gabbia di accoppiamento alla tazza. Per segnare le spermatece femmine, anestetizzare a freddo le zanzare femmine sul ghiaccio per almeno cinque minuti prima della dissezione al microscopio stereo. Seziona la zanzara femmina sotto lo stereomicroscopio.
Esaminare le spermatece al microscopio. Se la femmina non viene inseminata, tutte e tre le spermatece sarebbero vuote e, se inseminate, due o tre delle spermatece sarebbero riempite con spermatozoi mobili. Per gli individui inseminati, determinare se le spermatece contengono liquido seminale marcato Rhodamine B esaminandoli sotto lo stereomicroscopio fluorescente dotato di un filtro RFP1.
Se le spermatece sono riempite con liquido seminale che non è contrassegnato con Rodamina B, non si osserva fluorescenza. D'altra parte, se la spermateca contiene Rhodamine B marcato liquido seminale, sarebbe fluoresce arancione. L'obiettivo di questo test di competitività dell'accoppiamento era determinare se ci potesse essere una perdita nella forma fisica dell'accoppiamento maschile dopo diverse generazioni di consanguineità.
Sono stati condotti triplicati sperimentali del test di competitività dell'accoppiamento e i dati di inseminazione sono mostrati qui. Le femmine selvatiche sono state inseminate dai maschi consanguinei o incrociati, con marcatura reciproca. I risultati mostrano che la percentuale di femmine inseminate dai maschi consanguinei o incrociati non è stata influenzata dalla marcatura Rhodamine B.
Una percentuale significativamente più alta di femmine accoppiate con i maschi outcross rispetto ai maschi consanguinei in tutti e tre i replicanti, indicando che la consanguineità potrebbe portare alla perdita di forma fisica dell'accoppiamento. È importante preparare gabbie extra di zanzare femmine. Non utilizzare zanzare femmine da una gabbia che è stata contaminata da zanzare maschio, poiché le femmine pre-inseminate renderebbero tutti i dati non validi.
Oltre al test di competitività dell'accoppiamento basato sul laboratorio, questa procedura può essere utilizzata in esperimenti di rilascio-ricatto di marcature per studiare la biologia dell'accoppiamento degli insetti, la dinamica della popolazione e la sua dispersione.
