Questo protocollo utilizza l'analisi istologica per ottenere robuste misurazioni morfometriche delle ferite eccisionali del topo. Utilizzando questa tecnica, possiamo analizzare l'intera ferita utilizzando un sottoinsieme di sezioni seriali, permettendoci di rilevare in modo più accurato difetti che altrimenti potrebbero essere persi. A dimostrare la procedura sarà Lindsey Rhea, una ricerca associata del mio laboratorio.
Dopo aver confermato la mancanza di risposta al riflesso del pedale in un topo adulto anestetizzato, applicare un unguento agli occhi dell'animale e utilizzare un clipper di rasoio elettrico in un movimento caudale-rostrale per rimuovere la pelliccia sul retro del mouse a livello della spalla. Utilizzare una lama di rasoio tenuta con un angolo di 20 gradi dalla parte posteriore in un movimento rostrale-caudale per rimuovere i capelli rimanenti dalla pelle esposta, quindi pulire la pelle con uno iodio di povidone e una salvietta per la preparazione dell'alcol isopropile al 70%. Per l'induzione della ferita, drappeggiare un asciugamano pulito a base di carta su una superficie piana coperta di cera dentale e posizionare il mouse sull'asciugamano in posizione prona.
Pizzicare la pelle del mouse tra le scapole lungo la linea mediana dorsale e tirare la piega della pelle sandwich lontano dal corpo. Passando il mouse in una posizione laterale, posizionare un pugno di biopsia della dimensione della ferita desiderata il più vicino possibile al corpo e consentire alla pelle di rilassarsi. Premere verso il basso sul punzone usando un movimento a dondolo per forare tutti gli strati della pelle e rimuovere le biopsie del pugno dalla ferita usando forbici sterili e pinzette per liberare il pugno dalla pelle circostante se necessario.
Quindi consentire al mouse di recuperare con monitoraggio e analgesia. Per l'analisi morfometrica del letto della ferita, aprire un'immagine digitale della ferita macchiata. Per impostare le preferenze di scala e misurazione, in Analizza selezionare Imposta scala e immettere la distanza in pixel, la distanza nota e l'unità di lunghezza.
Selezionate Globale (Global) e OK per mantenere la scala uguale per ogni immagine aperta e selezionate Analizza (Analyze) e Imposta misure (Set Measurements) per confermare che la casella area è selezionata. Per misurare la lunghezza della ferita, selezionare a mano libera e utilizzare lo strumento per tracciare lungo la giunzione dermica-epidermica, a partire dall'ultimo follicolo pilifero del tessuto illeso su un lato della ferita al primo follicolo pilifero del tessuto illeso dall'altro lato. Se l'epidermide non copre l'intera ferita, seguire la giunzione dermica-epidermica su un lato della ferita dove termina la lingua migrata e continuare a seguire l'aspetto superiore del tessuto di granulazione o la giunzione tra il tessuto di granulazione e la crosta fino a raggiungere la lingua migratare e il primo follicolo pilifero del tessuto illeso dall'altra parte della ferita.
Quindi fare clic su Analizza e misura. La lunghezza della misurazione apparirà nelle stesse unità impostate nella scala. Se l'epidermide non copre l'intera ferita, misurare la distanza tra ogni bordo d'attacco epidermico seguendo l'aspetto superiore del tessuto di granulazione o la giunzione tra il tessuto di granulazione e la crosta al primo follicolo pilifero.
Per misurare l'area della ferita, utilizzare lo strumento a mano libera per tracciare lungo l'aspetto superiore dell'epidermide o l'aspetto superiore del tessuto di granulazione a partire dall'ultimo follicolo pilifero del tessuto illeso su un lato della ferita al primo follicolo pilifero del tessuto illeso dall'altro lato. Continuare a tracciare verticalmente lungo il follicolo pilifero nel tessuto di granulazione. Una volta raggiunto il follicolo pilifero opposto e il tessuto o il muscolo adiposo, seguire il bordo inferiore del tessuto di granulazione sul lato opposto della ferita e unire il punto di partenza lungo il follicolo pilifero per chiudere l'area.
Se la ferita non è completamente epiteliale, tracciare lungo l'aspetto superiore dell'epidermide fino al bordo anteriore e tornare al punto di partenza seguendo la giunzione dermico-epidermica. Come illustrato, quando si esrendono misurazioni 2D su tutta la ferita, siamo stati in grado di calcolare parametri non possibili con l'analisi 2D solo al centro della ferita, che è un metodo comunemente usato sul campo. In questo esperimento, sono state utilizzate e medie misurazioni 2D dell'area della ferita sull'intera ferita o su un sottoinsieme centrale della ferita e non hanno rivelato alcuna differenza significativa tra i gruppi sperimentali o i metodi di analisi.
Il volume della ferita calcolato, tuttavia, era significativamente diverso tra i gruppi sperimentali, dimostrando l'importanza di un'analisi istologica approfondita dei parametri di guarigione delle ferite. Generare ferite di dimensioni costanti per l'analisi istologica ed eseguire rigorosi sessantazioni seriali è fondamentale per un'accurata analisi morfometrica. Le sezioni non macchiate possono essere utilizzate per l'immunofluorescenza o la colorazione tricroma di Masson per misurare altri aspetti della guarigione delle ferite, mentre le ferite congelate flash possono essere utilizzate insieme alla morfometria per l'analisi quantitativa delle proteine.
