Questo metodo ci permette di caratterizzare quali farmaci chemioterapici sono idrolizzati da SAMHD1 e possono essere utilizzati come test di screening per identificare piccole molecole inibitrici di questo enzima. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è semplice, poco costosa e fornisce una grande quantità di informazioni su come diverse piccole molecole interagiscono con questo enzima. A dimostrare la procedura sarà Miriam, postdoc del gruppo.
Per iniziare, preparare il tampone di reazione SAMHD1 completo aggiungendo Tween-20 e TCEP alle concentrazioni finali rispettivamente dello 0,005% e dello 0,3 millimolare. Preparare la soluzione di arresto dell'EDTA aggiungendo EDTA a una concentrazione finale di 7,9 millimolari nel tampone di reazione SAMHD1 completo. Preparare il verde malachite o la soluzione di lavoro MG mescolando 10 parti di soluzione madre MG con 2,5 parti di molibdato di ammonio al 7% e 0,2 parti di Tween-20 all'11%.
Utilizzando una pipetta multicanale, diluire in serie i composti di prova nel solvente pertinente a 100 volte la concentrazione finale in una piastra trasparente a fondo tondo in polipropilene a 96 pozzetti. diluire ulteriormente questi composti a 25 volte la concentrazione finale con un tampone di reazione SAMHD1 completo per mantenere la concentrazione finale del solvente al di sotto dell'1%Trasferire cinque microlitri di componente diluito nei pozzetti appropriati di una piastra di analisi trasparente a fondo piatto da 384 pozzetti e ripetere la procedura con campioni di controllo di solo solvente. Per la preparazione della miscela madre enzimatica, diluire la proteina SAMHD1 umana ricombinante e la pirofosfatasi ricombinante in tampone di reazione SAMHD1 completo fino a quattro volte la concentrazione finale desiderata.
Preparare l'attivatore o il substrato dGTP diluendo la soluzione in un tampone di reazione SAMHD1 completo per raggiungere una concentrazione di 50 micromolari. Ai pozzetti contenenti diluizioni composte e controllo solo solvente, erogare cinque microlitri di miscela master di pirofosfatasi SAMHD1 e ai pozzetti di controllo senza enzimi, aggiungere cinque microlitri di tampone di reazione SAMHD1 completo. Quindi erogare 10 microlitri di soluzione dGDP in tutti i pozzetti per avviare la reazione e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
Per arrestare la reazione, aggiungere 20 microlitri di soluzione di arresto EDTA. Dopo aver aggiunto 10 microlitri di soluzione di lavoro MG a tutti i pozzetti, mescolare il contenuto utilizzando uno scuotitore orbitale per micropozzetti e centrifugare la piastra a 1000 x g per un minuto. Incubare la piastra per 20 minuti a temperatura ambiente e leggere l'assorbimento a 630 nanometri in un lettore di piastre a micropozzetti.
Calcolare la deviazione standard dei pozzetti di controllo positivo e quindi calcolare la media. Allo stesso modo per i pozzetti di controllo negativo, calcolare la deviazione standard e quindi calcolare la media. Calcolare il fattore Z è un indicatore della qualità del saggio.
Normalizzare ogni valore di assorbanza ai valori medi dei controlli positivi e negativi. Impostazione del controllo positivo come attività SAMHD1 al 100% e del controllo negativo come attività SAMHD1 allo 0%. L'attività di SAMHD1 è una funzione della concentrazione del composto e si adatta a una curva dose-risposta a pendenza variabile a quattro parametri, consentendo la determinazione della concentrazione inibitoria semimassima del composto.
Diluire le scorte di analoghi nucleotidici e completare il tampone di reazione SAMHD1 a quattro volte la concentrazione finale e trasferire cinque microlitri nei pozzetti appropriati di una piastra di analisi da 384 pozzetti. Per preparare l'enzima SAMHD1 o la miscela madre della pirofosfatasi, diluire la proteina umana ricombinante SAMHD1 e la pirofosfatasi di Escherichia coli in un tampone di reazione SAMHD1 completo fino al doppio della concentrazione finale desiderata. Preparare solo la soluzione di pirofosfatasi diluendo la pirofosfatasi ricombinante di Escherichia coli al doppio della concentrazione finale desiderata nel tampone di reazione SAMHD1 completo.
Allo stesso modo, preparare gli attivatori GTP e dGTP alfa S diluendo il brodo in tampone di reazione SAMHD1 completo a quattro volte la concentrazione finale. Erogare cinque microlitri dell'attivatore, GDP o dGTP alfa S o tampone di reazione SAMHD1 completo nei pozzetti appropriati di una piastra di analisi a 384 pozzetti contenente gli analoghi nucleotidici. Iniziare la reazione erogando 10 microlitri di miscela master di pirofosfatasi SAMHD1, pirofosfatasi da sola o tampone di reazione SAMHD1 completo nei pozzetti appropriati e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
Dopo aver interrotto la reazione utilizzando la soluzione di arresto EDTA, aggiungere 10 microlitri di soluzione di lavoro MG a tutti i pozzetti. Una volta miscelato il contenuto, centrifugare la piastra a 1000 x g per un minuto e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Quindi misurare l'assorbanza a 630 nanometri.
Calcolare i valori medi di assorbanza per i pozzetti di reazione della sola pirofosfatasi, che sarà il valore di fondo. Quindi sottrarre il valore di fondo dai pozzetti corrispondenti nelle reazioni SAMHD1 o pirofosfatasi. Infine, tracciare i valori di assorbanza corretti per ciascun analogo nucleotidico con le condizioni tampone GTP e dGTP alfa S.
Nel presente studio, l'assorbente è aumentato con l'aumentare della concentrazione di fosfato di sodio dopo l'incubazione con reagente verde malachite e ha raggiunto la saturazione a una concentrazione di 0,25 millimolari. L'intervallo di rilevamento lineare del fosfato è visibile da 0,004 a 0,03 millimolari. Viene illustrato il requisito dei componenti del saggio per ottenere un'attività SAMHD1 misurabile.
Né SAMHD1 né la pirofosfatasi da sole potrebbero generare un fosfato organico in presenza di dGTP. Tuttavia, quando tutti i componenti del saggio erano presenti, è stato osservato un aumento del segnale. Le curve dose-risposta ottenute per i composti inibitori di SAMHD1 hanno mostrato che l'aumento delle concentrazioni inibisce efficacemente l'attività di SAMHD1.
L'idrossiurea non inibisce l'attività di SAMHD1 in vitro, che è stata indicata dall'attività di SAMHD1 inalterata con l'aumento delle dosi di idrossiurea. Il legame del dGTP con entrambi i siti allosterici attiva SAMHD1, consentendo la successiva idrolisi di questo nucleotide, mentre gli altri tre dNTP canonici richiedono prima l'attivazione del GTP del primo sito allosterico prima di poter legare il secondo sito allosterico e quindi essere idrolizzati nel sito catalitico. Per gli analoghi nucleotidici, la clofarabina trifosfato è un attivatore del sito allosterico due e un substrato poiché l'attività è osservata in presenza di GTP.
Mentre la citarabina trifosfato è in grado di occupare solo il sito catalitico poiché dGTP alfa S è necessario per osservare l'attività. Non è stata osservata alcuna attività con gemcitabina trifosfato. A seguito dell'identificazione di piccole molecole che inibiscono SAMHD1 in questo test mediante approcci fisici, come i saggi di spostamento termico, può essere utilizzato per interrogare l'impegno del bersaglio.
Il metodo qui mostrato ci ha aiutato a capire quale dei farmaci antitumorali può essere idrolizzato da SAMHD1 e stabilire questo enzima come potenziale bersaglio terapeutico per superare la resistenza ai farmaci.
