Il sostegno della Australian Institute of Nuclear Science and Engineering è riconosciuto. TCK è stato il destinatario di premi AINSE. Lab Medicina epigenomic è supportata dal National Health and Medical Research Council of Australia (566.559). LM è supportato da Melbourne di ricerca (Università di Melbourne) e borse di studio integrative Biomedical Imaging CRC. Il supporto di Monash Micro Imaging (Dr. Stephen Cody e Iska Carmichael) è stata preziosa per questo lavoro. MMT è grata per l&#39;assistenza di esperti e la consulenza del Dr. Olga Sedelnikova dal National Institutes of Health.

Tessuti <ol><li> Tessuto polmonare, incorporati in stampi in temperatura ottimale di taglio (OCT) composto 4583, è stato sezionato (5 micron) utilizzando un criostato Leica CM 1950, montato su poli-L-lisina diapositive. </li></ol> I campioni congelati sono stati ottenuti dal dottor Simon Royce a bambini di Murdoch Research Institute. Tessuto polmonare è stato ottenuto da Balb non trattata / c topi e da un modello murino della malattia allergica cronica delle vie aeree che mostra molte delle caratteristiche patologiche di asma umano 6. Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dal Comitato Etico della Animal Research Institute Children Murdoch che aderisce al Codice di Pratica australiano per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio per scopi scientifici. <ol start="2"><li> Le sezioni sono stati lasciati asciugare all&#39;aria a temperatura ambiente per 1 ora. </li></ol> Immunofluorescenza <ol><li> Le sezioni sono stati fissati con il 2% (w / v) paraformaldeide in tampone fosfato (PBS) per 20 minuti. </li><li> Sezioni sono state equilibrata con due lavaggi in PBS per 15 minuti ciascuno. </li><li> Le sezioni sono state trattate con etanolo al 70% (refrigerate a -20 ° C) per 20 minuti, seguita da tre lavaggi in PBS per 10 minuti ciascuno. </li></ol> A questo punto i vetrini possono essere conservati in contenitori sigillati a 4 ° C per un massimo di 2 settimane. <ol start="4"><li> Le sezioni sono state lavate tre volte con PBS per 10 minuti ciascuna e quindi bloccato con 100μL preparati al momento in PBS contenente 8% di BSA in PBS contenente 0,5% Tween-20 e dello 0,1% Triton X-100 (PBS-TT) per 1 ora a temperatura ambiente . Tutte le incubazioni sono state eseguite in una vasca colorazione umidificato. </li><li> Sezioni sono state lavate con PBS-TT per 5 minuti e un perimetro idrofobico è stato segnato in tutto il tessuto con una penna Pap. </li><li> Tampone in eccesso è stata una soffiata e 100μl di primario policlonale di coniglio anti-γH2AX anticorpi (diluito 1:500 in 1% BSA in PBS, Millipore), è stata aggiunta ad ogni sezione per un 2 ore di incubazione a temperatura ambiente. Incubazione con anticorpo primario può essere eseguito durante la notte a 4 ° C. Per ulteriori prove, che rappresentano focolai γH2AX DSB, un anticorpo primario riconoscere una proteina riparazione DSB può anche essere usato. Per esempio, co-localizzazione di γH2AX e fosfo-ATM è una combinazione di uso comune. </li><li> Le sezioni sono state lavate due volte in PBS-TT per 5 minuti ciascuno e incubato con 100μl di anticorpo secondario (Alexa Fluor 488 di capra anti-IgG di coniglio diluito 1:500 in 1% BSA, Invitrogen) per 1 ora a temperatura ambiente al buio . (Anticorpo diluito è stato tenuto al buio tutta la procedura). </li><li> Le sezioni sono state lavate tre volte con PBS-TT per 5 minuti ciascuno e incubate con 0.5mg/mL RNase A per 30 minuti a 37 ° C. </li><li> Nucleare di contrasto e di montaggio è stato eseguito con mezzo Vectashield contenenti ioduro di propidio. </li><li> I vetrini sono stati sigillati con smalto e conservato durante la notte a 4 ° C al buio prima dell&#39;analisi. </li></ol> Microscopia / Analisi <ol><li> A Meta Zeiss LSM510 microscopio confocale è stato utilizzato per acquisire immagini utilizzando la GFP standard (per γH2AX - Alexa Fluor 488 di capra anti-IgG di coniglio) e PI (543 nm). </li></ol> Le immagini sono state acquisite in una serie Z tracciato con dimensione del passo di 0,5 micron. Durante l&#39;analisi, i piani individuali sono stati deconvoluted e impilati per produrre una immagine proiettata al massimo per minimizzare la sovrapposizione dei focolai. Il metodo di creazione di una immagine proiettata al massimo prima di un numero di particelle deve essere utilizzato solo in circostanze in cui viene utilizzata una sezione sottile (ad esempio 5 micron) e dove la colorazione di fondo è insignificante. Dove più spesso le sezioni con un significativo background deve essere analizzato, una analisi più complesse come Contatore oggetto 3D come descritto da Bolte e Cordelieres (2006) deve essere usato 7. <ol start="2"><li> Metamorph (Molecular Devices, USA) è stato utilizzato per creare fusi (rosso e verde) immagini per quantificare il numero di focolai. </li></ol> Anche se Metamorph può essere utilizzato per quantificare i numeri focolai, derivante dall&#39;uso di sezioni di tessuto focolai vengono conteggiati manualmente (ad occhio) per una maggiore precisione. Specifici tipi cellulari di interesse possono essere selezionati per la quantificazione, per esempio le cellule epiteliali del polmone. Ciò può essere fatto sulla base di istologia e con riferimento al ematossilina e eosina sezioni colorate seriale.

<ol>
	<li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo.">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li><li>Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma+H2AX+and+cancer.">Gamma H2AX and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li><li>Dickey, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2AX:+functional+roles+and+potential+applications.">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).</li><li>Bhogal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+residual+gamma-H2AX+foci+in+murine+skin+are+dose+responsive+and+predict+radiosensitivity+in+vivo.">Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo.</a> Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).</li><li>Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gamma-H2AX+as+a+biomarker+of+DNA+damage+induced+by+ionizing+radiation+in+human+peripheral+blood+lymphocytes+and+artificial+skin.">gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin.</a> Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).</li><li>Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+airway+remodeling+in+acute,+subacute,+and+chronic+models+of+allergic+airways+disease.">Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).</li><li>Bolte, S. &. a. m. p. ;. a. m. p., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ai fini di questa dimostrazione abbiamo usato tessuto polmonare del mouse non trattati da Balb / c topi e da un modello murino della malattia allergica cronica delle vie aeree. Abbiamo quantificato differenze nel numero di focolai per cella con medie leggermente più alto osservato nei polmoni danneggiati rispetto a sezioni non trattati. In particolare, la quantificazione indicato per 6,5 focolai / cellulare e del 9,4 per focolai / cella (conteggio manuale di 20 cellule per sezione), nei tessuti non trattati e cronica m...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A7906</td>
<td>BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS (without Ca2+ and Mg2+)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17-517Q</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound 4583</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tissue-Tek</td>
<td>4583</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Superfrost Plus</td>
<td>Polysine slides</td>
<td>Menzel-Gl&auml;ser, Germany</td>
<td>SF41296SP</td>
<td>Electrostatically attracts frozen tissue sections and reduces the need for additional coatings and adhesives.</td>
</tr>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>Reagent</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>655205</td>
<td>Tween 20 (0.5%), is a detergent to permeabilise cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T8787</td>
<td>Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>158127</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-phospho-&gamma;H2AX (rabbit polyclonal antibody)</td>
<td>Primary Antibody</td>
<td>Upstate, USA</td>
<td>07-164</td>
<td>Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
<td>Secondary Antibody</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A-11008</td>
<td>Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>Ethanol (70%)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher</td>
<td>BSPEL316</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNAse A</td>
<td>Reagent</td>
<td>Qiagen </td>
<td>19101</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vectashield PI</td>
<td>Reagent</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>H-1300</td>
<td>A glycerol based mounting medium containing propidium iodide (a red nuclear stain).This medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. 
Note: DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser.</td>
</tr>
<tr>
<td>Mini PAP Pen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen, USA</td>
<td>008877</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslips (22x50mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Menzel-Gl&auml;ser, Germany</td>
<td>CS2250100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coplin Jar, glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grale Scientific P/L</td>
<td>1771-OG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining Trough</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grale Scientific P/L</td>
<td>V1991.99</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zeiss LSM 510 Meta Confocal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Confocal Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CM Leica 1950 Cryostat</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica Microsystems</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Metamorph</td>
<td>Software for Imaging analysis</td>
<td>Molecular Devices, USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

quantitation of &gamma;h2ax foci in tissue samples

DNA a doppio filamento (DSB) sono lesioni particolarmente letali e genotossici, che possono derivare sia da processi endogeni (fisiologici o patologici) o da fattori esogeni, in particolare le radiazioni ionizzanti e composti radiomimetici. Fosforilazione della variante dell&#39;istone H2A, H2AX, alla serina-139 residui, altamente conservati nel C-terminale motivo SQEY, formando γH2AX, è una risposta precoce al DNA a doppio filamento<sup&gt; 1</sup&gt;. Questo evento fosforilazione è mediata dalla fosfatidil-inosito 3-chinasi (PI3K) famiglia di proteine, atassia telangiectasia mutati (ATM), DNA-proteina chinasi subunità catalitiche e ATM e RAD3-correlate (ATR)<sup&gt; 2</sup&gt;. Nel complesso, i risultati induzione DSB nella formazione di discreto nucleare γH2AX focolai che può essere facilmente individuato e quantificato mediante microscopia di immunofluorescenza<sup&gt; 2</sup&gt;. Data la specificità unica e la sensibilità di questo marcatore, l&#39;analisi di focolai γH2AX ha portato ad una vasta gamma di applicazioni nella ricerca biomedica, in particolare in biologia e medicina nucleare radiazioni. La quantificazione di γH2AX focolai è stata più ampiamente studiato in sistemi di colture cellulari nel contesto delle radiazioni ionizzanti indotte DSB. Oltre radiosensibilità cellulare, immunofluorescenza test basato sono stati utilizzati anche per valutare l&#39;efficacia di radiazione che modificano composti. Inoltre, γH2AX è stato utilizzato come marcatore molecolare per esaminare l&#39;efficacia di vari composti che causano DSB ed è recentemente annuncia come importante marker di invecchiamento e malattie, in particolare il cancro<sup&gt; 3</sup&gt;. Inoltre, immunofluorescenza metodi basati sono stati adattati per soddisfare il rilevamento e la quantificazione delle foci γH2AX<em&gt; Ex vivo</em&gt; E<em&gt; In vivo</em<sup&gt; 4,5</sup&gt;. Qui, dimostriamo un metodo tipico di immunofluorescenza per il rilevamento e la quantificazione di γH2AX focolai nei tessuti del mouse.

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Quantitation of &amp;#947;H2AX Foci in Tissue Samples

La quantificazione di DNA a doppio filamento sulla base di γH2AX focolai è diventato uno strumento prezioso, in particolare in biologia radiazione, per la valutazione della radiosensibilità dei tessuti e gli effetti dei composti radiazione modificando. Qui mostriamo l&#39;utilizzo di un test di immunofluorescenza per la quantificazione del γH2AX focolai in campioni di tessuto.

ΓH2AX quantificazione dei Foci, a campioni di tessuto

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

quantitation-of-h2ax-foci-in-tissue-samples

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

14.3K Views.  The Alfred Medical Research and Education Precinct. La quantificazione di DNA a doppio filamento sulla base di γH2AX focolai è diventato uno strumento prezioso, in particolare in biologia radiazione, per la valutazione della radiosensibilità dei tessuti e gli effetti dei composti radiazione modificando. Qui mostriamo l'utilizzo di un test di immunofluorescenza per la quantificazione del γH2AX focolai in campioni di tessuto.