Questo protocollo è significativo perché fornisce la procedura completa per la creazione di goccioline dal film lipidico alla soluzione lipidica alle microbolle e quindi alle goccioline. Il vantaggio principale di questa tecnica è la semplicità per condensare le microbolle in goccioline. Solo raffreddando e vorticando, le goccioline possono essere fatte senza la necessità di pressurizzazione.
Una dimostrazione visiva è fondamentale perché un semplice test per vedere se le microbolle sono state condensate con successo è controllando visivamente il cambiamento nella traslucenza. A dimostrare la procedura sarà Kimoon Yoo, allievo di un master nel laboratorio di Gang Zheng. Utilizzando un decapper, rimuovere il sigillo di alluminio sul flaconcino di siero e trasferire un millilitro della soluzione lipidica in una fiala campione di vetro borosilicato da 1,85 millilitro con un tappo a vite fenolica lasciando che la soluzione lipidica scorra lungo la parete interna senza creare bolle.
Con il flaconcino campione da 1,85 millilitro prepararsi a fluire in gas decafluorobutano nello spazio di testa del flaconcino del campione utilizzando lo scambiatore di gas. Assicurarsi che tutte le valvole dello scambiatore di gas siano chiuse correttamente e che la pompa sia spenta. Aprire la valvola del collettore e rimuovere con cautela l'ago corrispondente dal collettore.
Aprire la valvola di pressione A e la valvola di pressione B e ruotare la valvola del cilindro del gas di circa 1/16 a 1/8 in senso antiorario per aprirla parzialmente. Aprire la valvola della maniglia a T e srotolare il flaconcino del campione con la soluzione lipidica. Posizionare l'ago del collettore sopra l'interfaccia dell'aria liquida del flaconcino, ruotare lentamente la valvola del regolatore dell'aria in senso orario fino a quando l'ago del misuratore del regolatore dell'aria si sposta leggermente dalla sua posizione di riposo e lasciare che il gas perfluorocarburi fluisca delicatamente nello spazio di testa del flaconcino per 30 secondi, facendo attenzione a non creare bolle.
Regolare la valvola del regolatore dell'aria, se necessario. Dopo 30 secondi, conservare con cura e rapidamente il flaconcino del campione senza muovere troppo il flaconcino. Sia la valvola del cilindro del gas, la valvola della maniglia a T, la valvola del regolatore dell'aria, la valvola di pressione A, la valvola di pressione B e la valvola del collettore.
Inghinare con cura l'ago, quindi etichettare il flaconcino del campione e sigillare il collo con pellicola di cera andando in senso orario. Conservare il flaconcino del campione al buio e a quattro gradi Celsius per almeno 10 minuti o fino a 24 ore. Mettere circa 100 grammi di ghiaccio secco in un contenitore isolato in un contenitore isolato in un altro contenitore isolato.
Recupera una fiala di siero di decafluorobutano precedentemente preparata su aghi da 1,5 pollici calibro 20, una siringa di plastica da un millilitro, un contenitore da 200 millilitri, pinze metalliche e un termometro. Posizionare il flaconcino campione con la soluzione lipidica nell'agitatore meccanico e agitare per 45 secondi. Ci dovrebbe essere un cambiamento di colore e traslucenza.
Dopo l'agitazione meccanica, tenere il flaconcino del campione sul lato destro al riparo dalla luce e iniziare un conto alla rovescia di 15 minuti per raffreddare il flaconcino e selezionare le microbolle. Quando il conto alla rovescia ha raggiunto i 10 minuti, riempire un contenitore con circa 200 millilitri di isopropanolo e raffreddarlo a meno 20 gradi Celsius con ghiaccio secco usando pinze metalliche. Dopo che le microbolle sono state selezionate per 15 minuti, cercare la dimensione selezionata della partizione all'interno del flaconcino campione.
Mantenendo il flaconcino del campione sul lato destro verso l'alto, srotolare accuratamente il flaconcino del campione e prelevare circa 0,7 millilitri della partizione inferiore con un ago da 1,5 pollici calibro 20 attaccato a una siringa di plastica da un millilitro. Assicurarsi che nessuna delle partizioni superiori sia ritirata e non far scorrere la siringa per rimuovere le sacche d'aria. Puntando al cerchio centrale sul tappo di gomma, inserire un ago diverso calibro 20 in una fiala di siero di decafluorobutano mantenendo l'ago vicino alla parte superiore della fiala di siero per sfogare e quindi inserire l'ago con le microbolle selezionate di dimensioni selezionate.
Trasferire lentamente le microbolle selezionate di dimensioni. Lasciare che il liquido scivoli delicatamente lungo la parete interna del flaconcino di siero di decafluorobutano. Una volta trasferita tutta la soluzione di microbolle selezionata, rimuovere l'ago con la siringa, ma tenere l'ago di sfiato per alleviare la pressione negativa.
Aggiungere piccole quantità di ghiaccio secco o isopropanolo a temperatura ambiente al bagno di isopropanolo per garantire che la temperatura del bagno sia compresa tra meno 15 e meno 17 gradi Celsius. Con l'ago di sfiato calibro 20 inserito vicino alla parte superiore del flaconcino di siero, posizionare il flaconcino di siero e il bagno di isopropanolo, mantenendo il livello della microbolla al di sotto del livello dell'isopropanolo, ma il collo del flaconcino sopra di esso e a intermittenza ruotare il flaconcino di siero per due minuti per condensare le microbolle. Non far roteare continuamente il flaconcino di siero nell'isopropanolo e non lasciare che la soluzione si congeli.
Ruotare per circa cinque secondi e sollevare il flaconcino di siero dall'isopropanolo. Controllare la nucleazione del ghiaccio, quindi riprendere a turbinare in isopropanolo. Se c'è formazione di ghiaccio, ruotare la fiala di siero nell'aria fino a quando non si dissipa.
Dopo i due minuti di condensazione rimuovere il flaconcino di siero dal bagno di isopropanolo e rimuovere l'ago di sfiato. Le microbolle dovrebbero essersi condensate in goccioline come indicato dal cambiamento di traslucenza. Pulire il flaconcino di siero, etichettarlo e metterlo su ghiaccio normale in un contenitore isolato scuro fino al momento dell'uso.
Le goccioline non epri con una guarnizione in alluminio intatta dovrebbero essere stabili fino a sei ore finché il ghiaccio fuso viene sostituito secondo necessità. Quando è pronto per l'uso, rimuovere la guarnizione in alluminio con il decapper. Dopo aver utilizzato questo protocollo, microbolle precon condensate e selezionate e goccioline post-condensate sono state dimensionate su un contatore Coulter con un'apertura di 10 micron.
Vengono mostrati i dati di dimensionamento per la formulazione piro-lipidica al 30%. Le statistiche basate sui dati di dimensionamento sono mostrate qui. Utilizzando un rapporto tra diametri medie pre e post-condensati, i risultati hanno mostrato che all'aumentare del contenuto piro-lipidico, la concentrazione diminuiva e il diametro medio aumentava.
Vengono mostrate le misure rappresentative degli assorbenti del campione di goccioline piro-lipidiche al 30%. Ciò ha dimostrato che gli assemblaggi intatti hanno proprietà ottiche diverse riflesse da picchi diversi rispetto ai singoli componenti lipidici non assemblati. Qui vengono mostrate misurazioni rappresentative della microbolletta precon condensata, del campione di goccioline post-condensate con il 30% di pirolipidi, dimostrando diversi picchi di fluorescenza per campioni intatti nella forma interrotta.
Vengono mostrate immagini ecografiche rappresentative del campione di goccioline piro-lipidiche al 30% visualizzate a diverse pressioni. A basse pressioni, è stato osservato solo il segnale di fondo delle bolle d'aria bloccate dalla sintesi dell'agar. A una potenza leggermente superiore, sono state generate alcune microbolle, il che è dimostrato dalla comparsa di macchie luminose.
Più microbolle sono state generate all'aumentare della pressione. È importante ricordare che la temperatura di condensazione qui è ottimizzata per questa specifica formulazione di guscio di goccioline. Diverse formulazioni di shell possono richiedere una temperatura diversa.
