Questo protocollo descrive il sistema di dimerizzazione chimica per indurre condensati proteici sui telomeri. Può essere facilmente adattato per indurre condensati su altri loci genomici ed è adatto per sondare la formazione e la funzione dei condensati associati alla cromatina. Questo metodo offre la risoluzione temporale necessaria per l'imaging di cellule vive e mantiene la separazione di fase nella popolazione di cellule per i saggi biochimici.
Per iniziare, sciogliere i dimerizzatori in DMSO a 10 millimolari e conservarli in tubi di microcentrifuga di plastica a meno 80 gradi Celsius per la conservazione a lungo termine. Diluire un'aliquota di dimerizzatore 10 millimolare nel mezzo di imaging a una concentrazione di stock di 10 micromolari e conservarla a meno 20 gradi Celsius. Quando sono pronti per l'uso, diluire i dimerizzatori a una concentrazione finale di lavoro di 100 nanomolari nel mezzo di crescita o nel mezzo di imaging.
Semina da 10 a quinta cellule in vetri di copertura circolari da 12 millimetri di diametro rivestiti con Poly-D-Lysine in una piastra a sei pozzetti. Quindi trasfettate le cellule con i plasmidi mutanti Halo-GFP-TRF1 e mCherry-eDHFR-SIM o mCherry-eDFR-SIM e attendere da 24 a 48 ore prima di procedere all'immunofluorescenza. Aggiungere i 100 dimerizzatori nanomolari diluiti alle cellule e incubarli a 37 gradi Celsius per quattro-cinque ore.
Dopo l'incubazione, fissare le cellule in soluzione PBS contenente il 4% di formaldeide e lo 0,1% di Triton X-100 per 10 minuti a temperatura ambiente per permeabilizzare le cellule. Quindi lavare le cellule tre volte con PBS. Il coperchio di lavaggio scivola due volte con 50 microlitri di TBS-Tx e una volta con 50 microlitri di tampone di diluizione anticorpale.
Incubare ogni coperchio con 50 microlitri di anticorpi primari anti-PML, anti-SUMO-1 o anti-SUMO-2 e 3 a quattro gradi Celsius in una camera umidificata durante la notte. Il coperchio di lavaggio scivola tre volte con il tampone di diluizione degli anticorpi per rimuovere l'anticorpo primario non legato, quindi incubare le cellule con anticorpi secondari per un'ora in una scatola buia a temperatura ambiente. Dopo la colorazione, il coperchio di lavaggio scivola tre volte con TBS-Tx.
Etichettare le diapositive aggiungendo due microlitri di un microgrammo per millilitro DAPI, quindi capovolgere le scivolate del coperchio e posizionarle sulla goccia DAPI. Aspirare il fluido extra dal bordo dello slip di copertura. Sigillare la diapositiva con lo smalto, lasciarla asciugare e risciacquare la parte superiore del coperchio scivolare con acqua.
Posizionare i vetrini nel congelatore fino all'imaging. Semina da 10 a quinta cellule su vetri di copertura circolari da 12 millimetri rivestiti con Poli-D-Lisina in una piastra a sei pozzetti e trasfettali con plasmidi mutanti Halo-TRF1 e mCherry-eDHFR-SIM o mCherry-eDHFR-SIM. Fissare le cellule con il 4% di formaldeide per 10 minuti a temperatura ambiente e lavarle quattro volte con PBS.
Per IF-FISH, colorare le cellule con anticorpi primari e secondari e rifisserle con il 4% di formaldeide per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi lavarle quattro volte con PBS e disidratare le scivolate di copertura in una serie di etanolo. Incubare il coperchio scivola con la sonda C-PNA a telomeri 488 in cinque microlitri di soluzione di ibridazione a 75 gradi Celsius per cinque minuti, quindi incubare il coperchio scivola durante la notte in una camera umidificata a temperatura ambiente. Lavare le scivolate del coperchio tre volte con il tampone di lavaggio per due minuti per lavaggio a temperatura ambiente e montarle con un microgrammo per millilitro DAPI nel supporto di montaggio per l'imaging.
Per l'imaging dal vivo, montare il coperchio scivola in camere magnetiche su uno stadio riscaldato in una camera ambientale, mantenendo le celle in un millilitro di mezzo di imaging senza rosso fenolo. Impostare il microscopio e l'apparato di controllo ambientale come descritto nel manoscritto del testo. Individuare le cellule con un segnale GFP luminoso sui telomeri e un segnale diffusivo mCherry nel citosol.
Trova circa 20 celle, memorizza ogni posizione con le informazioni XYZ e imposta i parametri per l'imaging time-lapse. Utilizzare una spaziatura di 0,5 micrometri per un totale di otto micrometri in Z e un intervallo di tempo di cinque minuti per due o quattro ore per i canali GFP e mCherry. Utilizzare il 30% di 594 nanometri e il 50% di intensità di potenza di 488 nanometri, con tempi di esposizione di 200 millisecondi e un guadagno della fotocamera di 300.
Inizia l'imaging e fai un ciclo temporale come pre-dimerizzazione. Quindi mettere in pausa l'imaging, aggiungere 0,5 millilitri di supporti di imaging contenenti 15 microlitri di 10 dimerizzatori micromolari alla camera di imaging, facendo attenzione a non toccare lo stadio e riprendere l'imaging. Quando si è pronti per invertire la dimerizzazione, mettere in pausa l'imaging e aggiungere 0,5 millilitri di supporti di imaging contenenti due microlitri di TMP da 100 millimolari alla camera di imaging.
Continuare a eseguire l'imaging delle cellule per una o due ore. Per l'imaging fisso, utilizzare la stessa configurazione del microscopio dell'imaging dal vivo, ma senza il riscaldamento dello stadio. Individua da 30 a 50 celle con il segnale rosso da selezionare per le cellule trasfettate.
Acquisire immagini con una spaziatura di 0,3 micrometri per un totale di otto micrometri in Z.Utilizzare l'80% di 647 nanometri, l'80% di 561 nanometri e il 70% di intensità di potenza di 488 nanometri, con tempi di esposizione di 600 millisecondi e un guadagno della fotocamera di 300. La localizzazione telomerica di SUMO è stata identificata utilizzando il DNA dei telomeri FISH e l'immunofluorescenza della proteina SUMO. Le cellule con reclutamento SIM arricchite SUMO-1 e SUMO-2 e 3 rispetto alle cellule con reclutamento mutante SIM, indicando che l'arricchimento SUMO indotto dalla dimerizzazione SIM sui telomeri dipende dalle interazioni SUMO-SIM.
Un filmato time-lapse di TRF-1 e SIM dopo la dimerizzazione è mostrato qui. La SIM è stata reclutata con successo nei telomeri e sia i focolai SIM che TRF-1 sono diventati più grandi e più luminosi, come previsto per la formazione e la crescita di goccioline liquide. Inoltre, è stata osservata la fusione di focolai di TRF-1, che ha portato al raggruppamento dei telomeri, come mostrato nel ridotto numero di telomeri e nell'aumento dell'intensità dei telomeri nel tempo.
Al contrario, il mutante SIM è stato reclutato nei telomeri dopo la dimerizzazione, ma non ha indotto alcuna formazione di goccioline o clustering di telomeri, indicando che la separazione di fase e il clustering dei telomeri sono guidati dalle interazioni SUMO-SIM. L'inversione della separazione di fase e del clustering dei telomeri è stata osservata dopo l'aggiunta di TMP libero in eccesso. Il numero di telomeri è aumentato e l'intensità dei telomeri è diminuita nel tempo.
Immagini rappresentative di AFB identificate dal TELomero DNA FISH e dalla proteina PML IF sono mostrate qui. Le cellule con SIM reclutate hanno più AMB rispetto alle cellule con SIM mutante reclutato, suggerendo che i condensati indotti dalla dimerizzazione sono effettivamente AFB. Quando si esegue questo protocollo, non esporre alla luce dimerizzatori sensibili alla luce.
Lavora in una stanza buia con una lampada che emette luce rossa e avvolgi le cellule con un foglio di alluminio durante l'incubazione. Seguendo questa procedura, l'etichettatura di prossimità può essere utilizzata per generare un elenco completo di componenti nella condensa indotta. L'imaging dal vivo può essere utilizzato per seguire la dinamica dei componenti nella condensa.
Questi metodi possono aiutare a determinare i ruoli di governo del controllo della composizione della condensa.
