Lo scopo di questa procedura è quello di analizzare estratti vegetali mediante NMR a spostamento puro. Il seguente protocollo include aspetti chiave nella preparazione del campione da diverse matrici vegetali, foglie di vaniglia, tuberi di patata e frutti di uva spina del Capo, e la dettagliata procedura NMR passo-passo per registrare gli spettri ottimali della psiche di spostamento puro e dello ZAFFIRO. La profilazione metabolica mediante NMR protonica è l'arte di analizzare segnale per segnale nella miriade di segnali all'interno degli spettri NMR di una miscela biologica complessa con l'obiettivo di identificare ogni metabolita in questa miscela.
L'obiettivo è quello di rappresentare biomarcatori che potrebbero essere associati alla chemiotassonomia, alla fenotipizzazione, alle proprietà organolettiche, alla denominazione di origine, alle risposte metaboliche tra le altre importanti aree delle scienze vegetali. La risonanza magnetica nanica protonica è comunemente usata nella profilazione metabolica. Tuttavia, il gran numero di segnali con molteplicità di espansione confinate in un ristretto intervallo spettrale del prodotto porta a un'ampia sovrapposizione, complicando l'analisi e l'interpretazione dello spettro.
Tipicamente, una singola risonanza ha un'ampiezza che va da uno a cinque Hertz. Tuttavia, un segnale altamente accoppiato può diffondersi da oltre 25 a 50 Hertz, aumentando la probabilità di sovrapposizione del segnale. Per superare questa limitazione, applichiamo il moderno metodo NMR a spostamento puro per annunciare la risoluzione spettrale come mostrato qui in tre diversi scenari di impianto.
La preparazione del campione, la preparazione dell'estratto vegetale può essere eseguita in molti modi e la procedura dipenderà dalla matrice. I frutti dell'uva spina del Capo sono stati prima omogeneizzati in un succo. Le foglie di vaniglia sono state utilizzate intatte e le patate sono state affettate al riparo dall'ossidazione.
In tutti i casi, il materiale è stato liofilizzato, macinato e poi estratto. Per i frutti dell'uva spina del capo e le patate è stata utilizzata acqua per l'estrazione aiutata dalla sonicazione. Il surnatante è stato recuperato mediante centrifugazione, l'eventuale liquido è stato essiccato mediante liofilizzazione o aspirapolvere.
L'estratto secco è stato risospeso in tampone ossalato, evaporato a secco e ridisciolto in D2O contenente TMSP. Nel caso della vaniglia, l'estrazione è avvenuta direttamente utilizzando tampone fosfato deuterato contenente TMSP e metanolo deuterato. Anche il surnatante è stato recuperato mediante centrifugazione.
Tutti i campioni sono stati filtrati attraverso un filtro a siringa in PTFE e le provette NMR sono state riempite con 0,6 millilitri di soluzione filtrata. La preparazione dei campioni nella metabolomica NMR è fondamentale. Poiché la procedura verrà ripetuta forse centinaia di volte, dovrebbe essere preparata esattamente allo stesso modo, in modo da garantire che la varianza osservata non sia dovuta alla preparazione del campione, ma a reali differenze tra le piante studiate.
NMR a cambio puro. Lo spettro NMR si ottiene dopo la trasformata di Fourier del segnale FID. Il segnale FID può essere scomposto in due componenti, la modulazione dello spostamento chimico e la modulazione dell'accoppiamento J responsabile del modello di divisione dell'accoppiamento J.
La modulazione dell'accoppiamento J potrebbe essere rifocalizzata da un elemento di rifocalizzazione dell'accoppiamento J, che inverte selettivamente gli spin passivi mentre gli spin attivi rimangono inalterati. Dopo due ritardi uguali, l'accoppiamento chimico J è completamente rifocalizzato. L'elemento psichico basato su un esperimento anti-z-COSY è uno degli elementi di rifocalizzazione a banda larga più robusti e sensibili, proprietà che lo rendono adatto alla metabolomica NMR.
Gli esperimenti di spostamento puro si basano sulla rifocalizzazione dell'evoluzione dell'accoppiamento J durante la registrazione dello spostamento chimico. Ciò si ottiene in genere aumentando i ritardi per spostare il punto di rifocalizzazione dell'accoppiamento J. Poiché lo spostamento chimico evolve a una frequenza più alta rispetto all'accoppiamento J, un esperimento omonucleare disaccoppiato può essere registrato in modo interferogramma.
L'acquisizione dell'interferogramma, consiste nel registrare il FID per piccoli pezzi con il punto di rifocalizzazione dell'evoluzione dell'accoppiamento J, sempre coincidente con il centro del pezzo acquisito. Il FID disaccoppiato viene costruito concatenando ogni blocco successivo. Configurazione dell'acquisizione dei dati NMR, trasferimento dei campioni allo spettrometro NMR.
Sintonizzare e abbinare la testa della sonda, bloccare e spessorare il campione. Calibrare l'impulso duro a 90 gradi. Esegui uno spettro NMR protonico 1D standard.
Esperimento della psiche. Seleziona la sequenza di impulsi 1D della psiche di reset dalla libreria Bruker TopSpin. Impostare l'ampiezza dello spettro su cinque kilohertz.
Il ritardo di recupero del rilassamento ad almeno uno o due secondi. Il manichino scansiona a 16. Il numero di scansioni a 64 o 128 e il numero di punti dati complessi per blocco, 64 o 128, impostano l'eccitazione dell'angolo di inversione dell'impulso chirp desiderata.
Un buon compromesso tra sensibilità e bassi artefatti di riaccoppiamento è quello di impostare la costante da 61 a 20 gradi, 10 kilohertz per la larghezza di banda dell'impulso chirp. Impostare la lunghezza dell'impulso duro sul volume precedentemente calibrato e la lunghezza dell'impulso della forma della psiche su 30 millisecondi. Scegli il Crp_psyche.
20 impulsi di forma per l'elemento psiche. L'intensità del gradiente del campo impulsivo applicato durante l'elemento psiche è normalmente impostata tra l'uno e il 4% dell'intensità massima del gradiente, a seconda della sonda. Scegliere RECT.
1 per l'impulso di forma sfumata. Imposta il numero di blocchi da acquisire per ricostruire il FID di spostamento puro. In genere 16 o 32 blocchi con 64 o 128 punti complessi per blocco forniranno una risoluzione digitale sufficiente, eseguiranno lo spettro ed elaboreranno i dati.
Con il programma AU di Bruker proc_reset, e poi la trasformata di Fourier. Si consiglia di trasformare lo spettro utilizzando il riempimento zero e l'apodizzazione a campana sinusoidale. Psyche è un esperimento di pseudo interferogramma 2D.
Si tratta di un software da artefatto periodico a span laterale che arriva dall'evoluzione del piccolo accoppiamento J durante l'acquisizione di ciascun blocco che tipicamente varia da cinque a 20 millisecondi nell'analisi del composto puro, questi artefatti possono essere trascurati in quanto normalmente rappresentano meno del 5% del picco genitore. Tuttavia, in miscele complesse, l'artefatto di span laterale di alcuni metaboliti potrebbe essere grande o più grande del segnale di metaboliti meno concentrati, compromettendo l'accuratezza dell'analisi metabolica. Questi artefatti possono essere rimossi in modo efficiente utilizzando un esperimento di modifica della psiche chiamato SAPPHIRE psyche sviluppato nel Morris Lab SAPPHIRE psyche experiment.
Per ottenere lo spettro disaccoppiato, la sequenza di impulsi acquisisce piccoli pezzi di rifocalizzazione FID nell'accoppiamento J al centro di ciascun blocco. Tuttavia, durante ogni blocco si verifica una piccola evoluzione dell'accoppiamento J e genera gli artefatti periodici della banda laterale. L'esperimento della psiche SAPPHIRE è una modifica della sequenza psichica regolare in cui questi artefatti periodici vengono rimossi mediante modulazione di fase sistematica, ottenuta spostando il punto di rifocalizzazione J.
Dopo aver aggiunto ogni modulazione di fase, l'evoluzione residua dell'accoppiamento J è altamente soppressa, producendo uno spettro di spostamento puro molto più pulito. Selezionare la sequenza di impulsi SAPPHIRE psyche e impostare i parametri della sequenza di impulsi. Questa sequenza non è nel repertorio di Bruker, tuttavia, la sequenza e i programmi di elaborazione possono essere ottenuti dal sito web del gruppo di metodologia NMR di Manchester.
I parametri standard sono impostati sui seguenti valori, cinque kilohertz di larghezza spettrale, almeno uno o due secondi di ritardo di rilassamento. 16 scansioni fittizie, otto o 16 scansioni per incremento e D2 impostato su 14 millisecondi. Questo parametro assicura che il rilassamento T2 rimanga costante ad ogni incremento di modulazione J.
Impostare il valore di eccitazione dell'angolo di inversione dell'impulso chirp desiderato e la larghezza di banda dell'impulso. Impostare la lunghezza dell'impulso duro sul valore precedentemente calibrato e la lunghezza dell'impulso della forma della psiche su 30 millisecondi. Scegli l'impulso a forma PSYCHE_Saltire_10kHz_30m per l'elemento psiche.
Imposta l'intensità del gradiente del campo pulsato applicato durante l'elemento psiche. Scegliere RETT. 1 per la forma della sfumatura.
Imposta il numero di incrementi di modulazione Sapphire J in F2, normalmente otto incrementi assicurano un'eccellente soppressione degli artefatti della banda laterale. Impostare le finestre spettrali F1 e F2 calcolate dal valore della finestra spettrale F3 selezionato utilizzando le seguenti espressioni. La durata del blocco di spostamento puro, descritta come uno su SW1, è in genere impostata tra 20 e 40 millisecondi.
Imposta il numero di blocchi di spostamento puri. Poiché la psiche SAPPHIRE deve compensare la modulazione di fase di disaccoppiamento del primo blocco, è necessario aggiungere un blocco extra. In genere, 17 o 33 blocchi offrono una risoluzione digitale sufficiente.
Elaborare i dati, eseguire nei programmi pm_pshift e pm_fidadd AU seguiti dalla trasformata di Fourier, si consiglia di trasformare lo spettro utilizzando il riempimento zero e assegnare l'apodizzazione a campana. Risultati, gli esperimenti di SAPPHIRE sulla psiche aumentano la risoluzione degli spettri facendo collassare risonanze accoppiate in singoletti piacevolmente acuti, come si è visto dimostrato in tre diverse matrici vegetali. Foglie di vaniglia, frutti di Physalis Peruviana e tuberi di patata con molteplicità del complesso SAPPHIRE Psyche, ad esempio, gli idrogeni altamente accoppiati dell'acido omocitrico che generano segnali quasi continui che si espandono attraverso i 40 Hertz collassati in tre singoletti taglienti.
Riducendo l'affollamento che potrebbe mascherare altri segnali nell'area. L'ottenimento della risoluzione ha anche facilitato la chiara districazione della regione altamente sovrapposta tra 2,6 e 2,8 PPM in cui l'acido omocitrico è lattone e compaiono risonanze di acido malico. I biomarcatori chiave nella vaniglia, ad esempio, i cui segnali si sovrappongono a quelli dei glucosidi nella normale NMR protonica, sono stati meglio identificati negli spettri SAPPHIRE a causa di questo eccezionale guadagno in risoluzione. Conclusioni.
Pure shift è un nuovo eccellente strumento per la metabolomica delle piante. Ha aumentato drasticamente la risoluzione dello spettro e quindi consente una più facile identificazione dei metaboliti, un'analisi metrica di correlazione più fine e una migliore interpretazione dell'analisi multivariata. Dopo aver visto questo video, avrai una buona comprensione di come preparare diversi estratti di piano per l'analisi NMR e come registrare la psiche di spostamento puro ottimale e lo spettro della psiche SAPPHIRE.
