Gli autori desiderano ringraziare tutti i membri dei laboratori del dottor Barletta e il Dott. Powers per gli utili commenti durante lo sviluppo del protocollo. Ringraziamo Wendy Austin per le discussioni utili e correzione di bozze del manoscritto. Il lavoro descritto in questo manoscritto è stato finanziato da borse di studio pilota di semi per ogni investigatore di cui sopra presso la University of Nebraska-Lincoln Center Biologia Redox (genitore sovvenzione # NCRR 2P20RR 017675, D. Becker, PI). Inoltre, ringraziamo il Dr. Ofelia Chacon per fornire fondi da lei R21 sovvenzioni (1R21AI087561-01A1) per le forniture di ricerca e di sostegno stipendio parziale signor Halouska di standardizzare le tecniche NMR riportati nella presente pubblicazione.

1. Protocollo di testo Questo protocollo mette in evidenza l&#39;adattamento della metodologia NMR a M. tubercolosi (Classe III agente). Pertanto, le pratiche di biosicurezza di livello 3 (BSL3) devono essere seguite per lo svolgimento di M. ricerca tubercolosi in un laboratorio certificato annualmente. L&#39;esposizione al laboratorio generati aerosol è il pericolo più importante incontrato da personale che lavora con questi microrganismi. Le seguenti procedure si svolgono nel nostro istituto e possono variare in base alle raccomandazioni del Comitato Istituzionale biosicurezza. Personale comuni dispositivi di protezione consiste in un abito Tyvek, tappo bouffant, stivaletti, respiratore N95, protezione per gli occhi, maniche, e una doppia coppia di guanti in nitrile. Lavori comportanti M. culture tubercolosi e / o manipolazioni con aperto M. tubercolosi contenitori avviene nel tipo A2 o B2 cappa di sicurezza biologica. Plastica ricoperto di carta assorbente è posto sul wavorare superficie. Tutti i materiali / forniture da smaltire o rimuovere l&#39;impianto deve essere posto in due sacchi a rischio biologico e decontaminati in autoclave. Le superfici di lavoro e le attrezzature utilizzate all&#39;interno del cabinet (FastPrep-24 lisi omogeneizzatore, spettrofotometro, secchiello con ghiaccio, ecc) devono essere disinfettati dopo ogni sessione di lavoro con 1% Amphyl (tubercolicida, agente battericida, fungicida, virucida e). M. culture tubercolosi deve essere sottoposto a doppio contenimento per il trasporto di grandi attrezzature che si trovano al di fuori della cappa di sicurezza biologica, come congelatori, incubatori, centrifughe, e frigorifero. La centrifugazione è condotta con coppe di sicurezza chiusi e O-ring tubi con tappo a vite. Per ulteriori analisi fuori del laboratorio BSL3, estratti acellulari sono filtrati attraverso un filtro di 0,2 pm o microrganismi uccisi calore a 95 ° C per 15 min. Due campioni vengono piastrate per verificare l&#39;assenza di unità formanti colonie prima di rimuoverla dal contenimento. <ol><li> Trasferire 110 ml di mezzi completi Middlebrook 7H9 contenente polisorbato 80 (Tween 80 per evitare grumi) brodo (mADC-TW) o di un mezzo adatto a una beuta da 250 ml. Colture in triplicato sono regolarmente coltivati ​​a condizione quando si utilizza 13 C-metaboliti, e dieci culture identiche sono coltivate per 1D 1 profili H NMR. Per due condizioni (ad esempio, con e senza aggiunta di farmaci), volume doppio di cultura per replica possono essere coltivate e diviso in due culture identiche. Tutte le ricette reagenti e soluzioni sono forniti alla fine del protocollo. </li><li> Inoculare brodo con 0,150 ml di M. tubercolosi stock in glicerolo 50% (permette di scongelare il ghiaccio). Vedere la nota 1 di seguito. </li><li> Lasciate crescere la coltura a 37 ° C agitando a 100 rpm per circa 6 giorni (OD 600 0,6-0,8). Vedere la nota 2 di seguito. </li><li> Se non antibiotici, aggiunte alternativi o altri trattamenti sono necessari, le culture sono pronte per essere raccolte. Se i trattamenti vengono utilizzati, continuaredirettamente al punto 5. Rimuovere da 0,5 ml di campione da ciascuna beuta, trasferire in una provetta e posto a 4 ° C per la titolazione di cultura e di controllo della qualità: test di contaminazione, analisi fenotipica, test PCR. Vedere la nota 3. A questo punto, passare al punto 6. </li><li> Rimuovere staffe da shaker ed eseguire il trattamento desiderato (ad esempio, aggiungere farmaco o metabolita). Luogo boccette indietro nello shaker e incubare per un ulteriore periodo (ad esempio, 6-18 ore). Alla fine di questo tempo, prendere un&#39;altra aliquota 1,0 ml e determinare OD 600. Rimuovere da 0,5 ml di campione da ciascuna beuta, trasferire in una provetta e posto a 4 ° C per la titolazione di cultura e di controllo della qualità. </li><li> Luogo culture in ghiaccio per 5 min. Dopo questo passo, lasciare cellule in ghiaccio durante l&#39;intero protocollo rimanente. Culture Harvest mediante centrifugazione a 2.000 xg e 4 ° C per 15 minuti in provette da 50 ml con una centrifuga da banco. Ogni cultura richiede quattro provette con 25 ml ciascuno (per un totale di 100 ml è necessaria per ottenere un adeguato rapporto segnale-rumore per 2D 1 H-13 C esperimenti NMR, in cui è richiesto solo 50 ml per la cultura per 1D 1 H esperimenti NMR). </li><li> Lavare ciascun pellet cellulare due volte con ghiacciata DDH 2 O (circa 15 ml la prima volta e 10 ml la seconda volta) dai parametri di centrifugazione sopra descritti. Per il secondo lavaggio, combinare le aliquote da 10 ml nel tubo stesso prima della filatura. Risospendere il pellet di cellule in un volume finale di 1,0 ml DDH 2 O (necessario regolare il volume di pellet). Se una sospensione singola cella libera di aggregazione è desiderato in questa fase, le cellule possono essere brevemente sonicata e / o passare attraverso un ago calibro 27 per tre volte. In alternativa, il pellet cellulare può essere congelato a -80 ° C e conservato fino al procedimento successivo. In quest&#39;ultimo caso, pellet congelati vengono scongelati in ghiaccio prima risospensione. Risospendere il pellet di cellule in un volume finale di 1,0 ml DDH 2 O come sopra indicato. </li><li> Transfer la cella di 1,0 ml di sospensione in una provetta con tappo a vite contenente 2,0 ml lisi Matrix B (0,1 sfere di silice mm). Posizionare l&#39;omogeneizzatore FastPrep-24 lisi all&#39;interno dell&#39;armadio biosicurezza. Mettere i campioni nel portacampioni, garantire il mantenimento parlato sulla piastra superiore del tubo. Elaborare i campioni per 60 sec in omogeneizzatore ad una impostazione velocità di 6 metri / sec. </li><li> Centrifugare i campioni in una microcentrifuga a 15.000 xg e 4 ° C per 10 min a pellet cellulare detriti e cellule intatte. </li><li> Rimuovere campione surnatante e passa attraverso un filtro siringa (0,2 micron) in una provetta sterile. Piastra 0,1 ml di campione (o una frazione rappresentativa del campione, come per esempio 10%) su agar MADC per verificare che non vi siano cellule vitali. Investigatori possono anche effettuare più di una fase di filtrazione e / o verificare la presenza di cellule vitali negli estratti usando live-morti procedure di colorazione in modo da prevenire o individuare eventuali problemi potenziali biosicurezza. Congelarli in un etanolo-bagno di ghiaccio secco per memorizzarea -80 ° C fino a quando non sono pronti per essere liofilizzate e trasformati in un impianto NMR. </li><li> Dopo 2 mesi, controllare le piastre per verificare l&#39;assenza di unità formanti colonia. Se non CFU sono trovati, possono essere prelevati campioni di laboratorio BSL3. Ulteriori analisi viene effettuata in una struttura NMR standard, che normalmente serve multiutente e opera in nessun esigenze specifiche di contenimento. </li><li> Liofilizzare i campioni a secchezza, quindi risospendere in 0,7 ml di tampone NMR e trasferimento in una provetta da microcentrifuga. Centrifugare per 3 min a 13000 x g. Rimuovere 0,6 ml e trasferimento in un tubo NMR 5 mm. In alternativa, i campioni liofilizzati possono essere inviati a un impianto esterno di campioni regolari non a rischio biologico. </li><li> NMR dati vengono raccolti immediatamente. Nonostante tutte le precauzioni, enzimi attivi può essere ancora presente e il campione non è tipicamente stabile per lunghi periodi di tempo. Cambiamenti nello spettro NMR è evidente quando i campioni vengono lasciate a temperatura ambiente oppure a 4 ° C per mminerale di 1 settimana. Inoltre, la raccolta dei dati NMR si alterna tra le colture trattate e non trattate di droga, in cui i campioni sono scelti a caso per ogni categoria. Questo impedisce di polarizzazione necessario perché una determinata categoria ha avuto un ritardo più lungo prima gli spettri NMR sono stati raccolti. Una polarizzazione nei dati avverrebbe se gli spettri NMR per tutti i campioni non trattati sono stati raccolti prima, e poi seguito dai campioni di farmaci trattati. Se i campioni non possono essere immediatamente analizzati mediante NMR, i campioni devono essere conservati in 1 ml provette Eppendorf a -80 ° C. </li><li> Dopo aver inserito i campioni in un BACS-120 di campioni, la calibrazione degli strumenti, che coinvolge pochi passi di routine come la serratura, spessore, mettere a punto e ottimizzazione del 90 ° lunghezza di impulso, è necessaria per massimizzare la qualità dei risultati. Un solo campione viene utilizzato per calibrare il 90 ° lunghezza dell&#39;impulso e accordare lo strumento per i campioni rimanenti. Di bloccaggio, spessoramento, e la raccolta di dati NMR per ogni campione è automatizzato using ICONNMR e gradshim. </li><li> A 1D 1 H NMR vengono raccolti utilizzando il Bruker zgesgp sequenza di impulsi con soppressione dell&#39;acqua utilizzando scultura di eccitazione. Un totale di 32k punti di dati con una larghezza di spazzata 5482.5Hz, 128 scansioni e 16 scansioni fittizie sono utilizzati. Un 2D 1 H-13 C spettro HSQC vengono raccolti utilizzando il Bruker hsqcetgp sequenza di impulsi. Un totale di 2048 punti dati con una larghezza di scansione di 5000,0 Hz viene raccolto lungo la diretta 1 dimensione H, e 64 punti di dati con una larghezza di scansione di 18864,9 Hz lungo la dimensione indiretta 13 C. Lo spettro viene raccolto con 128 scansioni e 16 scansioni fittizie per ottenere buon segnale al rumore. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3673/3673fig1.jpg" /> Figura 1. Un diagramma di flusso delle procedure sperimentali è raffigurato. NMR del buffer Soluzione madre di 50 appassionato mM fosfato di potassioer con 50 TMSP pM: <ul><li> 2.17 g K 2 HPO 4 (potassio fosfato bibasico) </li><li> 1,70 g KH 2 PO 4 (potassio fosfato monobasico) </li><li> 7,86 mg di sodio-3-Trimethylsilylpropionate (TMSP-2 ,2,3,3-D 4 (D, 98%)) </li><li> Sciogliere in 500 ml di &quot;100%&quot; D 2 O </li><li> La soluzione finale è a pH 7,2 (non corretta) </li></ul> MADC-TW o MOADC-TW (1 L) <ul><li> 4,7 g di brodo Middlebrook 7H9 di base </li><li> 900 ml DDH 2 O </li><li> 2 ml glicerolo </li><li> Miscelare i componenti e autoclave per 25 min. Liquido freddo al tatto e aggiungere le seguenti soluzioni: </li><li> 100 ml ADC durante la preparazione mADC o 100 ml per la preparazione OADC MOADC </li><li> 2,5 ml 20% Tween 80 (in alternativa, 1 ml di non metabolizzabile tyloxapol 20%) </li><li> 10 ml cicloeximide 1% </li></ul> ADC (1 L) <ul><li> 20 g di D (+)-Glucosio </li><li> 50 g BSA FrazioneV </li><li> 8,5 g NaCl </li><li> 800 ml DDH 2 O </li><li> Sciogliere insieme, regolare il volume a 1 L e sterilizzare con 0,2 micron filtro. Conservare a 4 ° C. </li></ul> In alternativa, per preparare OADC (1L), aggiungere tutti i componenti sopra elencati più 50 ml di acido oleico 1% (ricetta sotto fa un lotto 250 ml). Sciogliere insieme, regolare il volume a 1 L e sterilizzare con 0,2 micron filtro. Bottiglia ha bisogno di essere avvolti in un foglio di alluminio e conservare a 4 ° C. <ul><li> 2,5 g Acido oleico </li><li> 250 ml di NaOH 0,2 M </li><li> Thaw acido oleico (solidifica sulla refrigerazione) mediante riscaldamento a 55 ° C per 10 min e aggiungere soluzione di NaOH e calore con agitazione per 60 min. Conservare in bottiglie di vetro sterili che vengono avvolti in fogli di alluminio. Sigillare con parafilm bottiglie e conservare a 4 ° C. </li></ul> Se si preferisce, è possibile acquistare commerciale BD BBL Middlebrook ADC o OADC con arricchimento catalasi. 1% cicloeximide (100ml) </strong&gt; <ul><li> 1 g cicloeximide </li><li> 100 ml DDH 2 O </li></ul> Sciogliere e sterilizzare con 0,2 micron filtro. Conservare a 4 ° C. Attenzione: cicloeximide è tossica quindi maneggiare con estrema cura. 20% (v / v) Tween 80 (100ml) <ul><li> 20 ml di Tween 80 </li><li> 80 ml ​​DDH 2 O </li></ul> In alternativa, pesano 20 g di Tween 80 (circa 18,9 ml; densità 1,06 g / ml), per preparare 20% w / v soluzione. Calore soluzione a 55 ° C per 30 minuti per sciogliere e miscelare completamente. Sterilizzare liquido con un 0,2 micron filtro. Conservare la soluzione finale a temperatura ambiente. 20% (v / v) tyloxapol (100ml) <ul><li> 20 ml tyloxapol </li><li> 80 ml ​​DDH 2 O </li></ul> In alternativa, pesano 20 g di tyloxapol (circa 18,2 ml; densità 1,1 g / ml), per preparare 20% w / v soluzione. Calore soluzione a 55 ° C per 30 min a dissolve, e mescolare completamente. Sterilizzare liquido con un 0,2 micron filtro. Conservare la soluzione finale a temperatura ambiente. Nota 1: le scorte della glicerina della M. tuberculosis vengono preparati utilizzando il seguente protocollo. Calza di M. tubercolosi <ul><li> Grow M. tubercolosi in 50 ml MADC a saturazione (OD 600 = 1,5 a 2,0) a 37 ° C in condizioni di agitazione (100 rpm). A seconda del ceppo, questo i 7-14 giorni. </li><li> Spin campioni a 2.000 xg a 4 ° C per 15 minuti alla cultura pellet. Rimuovere il surnatante. </li><li> Risospendere in 6 ml di glicerolo 50% sterile. </li><li> Distribuire 1.5 ml in 4 Corning fiale criogeniche ed etichetta in modo appropriato. </li><li> Immediatamente fiale freeze flash in etanolo / bagno di ghiaccio secco e conservare a -80 ° C. </li></ul> Nota 2: inoculo ceppo H37Rv (-80 ° C disponibile fino a 1,5 anni) in 70 ml di mADC supporto produce un OD 600 &lt;/&gt; Sub di circa 0,6 dopo 5 giorni di crescita a 37 ° C in condizioni di agitazione (100 rpm) a un Innova 40 Shaker. Nota 3: Per verificare la contaminazione della cultura, gli investigatori potrebbero inoculare un&#39;aliquota di cultura su guida standard medi ricchi e verificare l&#39;assenza di crescita dopo incubazione per una notte. Di routine, le colture vengono piastrate su agar mADC per osservare la morfologia delle colonie ed esaminare in contrasto di fase microscopio. Se lo si desidera, le culture può essere verificata mediante PCR utilizzando primers IS 6110 come descritto 3. 2. Risultati rappresentativi Un campione che è ben preparato produrrà uno spettro NMR simile a quello illustrato nella figura 2. Questo spettro è una rappresentazione del M. tubercolosi di tipo selvatico piscina metabolica. I metaboliti identificati sono direttamente o indirettamente associato al D-alanina pathway. Inoltre, la grandezza di intensità di picco è proporzionale alla concentrazione dei metaboliti presentarenell&#39;estratto cella. Pertanto i cambiamenti di intensità di picco tra le culture non trattate, trattamento farmacologico, e ceppi mutanti può indicare perturbazioni in metaboliti e vie metaboliche. Il M. tuberculosis 1D 1 H NMR sono stati raccolti su un Bruker Avance 500 MHz spettrometro dotato tripla risonanza, asse Z cryoprobe gradiente. Lo spettro contiene ca. 400 cime, da cui è stato possibile identificare e quantificare 40-50 metaboliti, tra cui aminoacidi, precursori di nucleotidi, e intermedi e acido citrico e glicolitici. Un commutatore di BACS-120 campione con il software Bruker Icon è stato utilizzato per automatizzare la raccolta dei dati NMR. 1D 1 H NMR sono stati raccolti usando scolpire eccitazione 4 per rimuovere efficacemente il solvente e mantenere una linea di base piatta, eliminando la necessità di raccolta basale che possono indurre artefatti nella successiva analisi delle componenti principali (PCA) o ortogonali almeno parziale analisi discriminante quadrati (OPLS- DA). A 1D 1 H NMR sono raccolte a 25 ° C con una larghezza di spettro 5482,5 Hz e 32K punti dati. Un totale di 16 scansioni dummy e 128 scansioni sono state utilizzate per ottenere lo spettro. La 1D ACD Labs NMR software del processore è stato utilizzato per semi-automatico elaborare tutte le 1D 1 H NMR. Gli spettri sono stati trasformata di Fourier, graduale, e fa riferimento al picco TMSP (0,0 ppm). Il pacchetto software NMRpipe stato utilizzato per elaborare singolarmente il 2D 1 H-13 C NMR e analizzati con NMRDraw. Il Bruker FID file di dati era stato convertito in un formato di file riconoscibile da NMRpipe e lo spettro è stata trasformata di Fourier, correzione di fase, e zero riempito. I picchi NMR osservati nel 1D 1 H NMR 2D e 1 H-13 C NMR sono assegnate a specifici metaboliti mediante 1 H e 13 C Tolleranze di chemical shift di 0,05 e 0,50 ppm, rispettivamente, e il Madison Metabolomica Consorzio Database (MMCD ), <sup&gt; 5 la BioMagResBank, 6 e il database umano metaboloma. 7 In particolare, gli spettri NMR 1D e 2D sono raccolte manualmente picco, dove la lista picco di NMR chemical shift viene poi caricato nel database umano metaboloma. I metaboliti identificati dal Database metaboloma umano sono assegnati allo spettro NMR basato sia massimizzare il numero delle corrispondenti risonanze NMR e appartenente ad una rete metabolica. Ogni composto o metabolita di solito ha più coppie CH e risonanze NMR corrispondentemente più. Così, più di queste risonanze NMR che si osservano nello spettro NMR sperimentale, più è probabile il metabolita è presente. Analogamente, identificando metaboliti multipli associati con lo stesso percorso aumenta la probabilità di assegnazioni corrette. La presenza di metaboliti e vie metaboliche sono verificati con l&#39;Enciclopedia di Kyoto dei geni e genomi (KEGG) 8 ei database MetaCyc 9. Mycobacterium smegmATIS è un sistema modello utile per M. tubercolosi e altri patogeni micobatteriche. Come descritto altrove, campioni di M. smegmatis potrebbe anche essere interrotto da sonicazione 10. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3673/3673fig2.jpg" /> Figura 2. 1D 1 H NMR del estratto cellulare Mycobacterium tuberculosis. Picchi NMR associati metaboliti rappresentativi sono etichettati. Abbreviazioni sono le seguenti: AMP, adenosina fosfato mono; α-Kg, α-chetoglutarato, Glu, glutammato e Ala, alanina.

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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+extraction+method+for+mycobacterial+metabolome+analysis.">Development of an extraction method for mycobacterial metabolome analysis.</a> J. Pharm. Biomed. Anal. 41, 196-200 (2006).</li><li>de Carvalho, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+of+Mycobacterium+tuberculosis+reveals+compartmentalized+co-catabolism+of+carbon+substrates.">Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates.</a> Chem. Biol. 17, 1122-1131 (2010).</li><li>de Carvalho, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-based+metabolomic+profiling+of+enzymatic+function:+identification+of+Rv1248c+as+a+mycobacterial+2-hydroxy-3-oxoadipate+synthase.">Activity-based metabolomic profiling of enzymatic function: identification of Rv1248c as a mycobacterial 2-hydroxy-3-oxoadipate synthase.</a> Chem. Biol. 17, 323-332 (2010).</li><li>Marrero, J., Rhee, K. Y., Schnappinger, D., Pethe, K., Ehrt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gluconeogenic+carbon+flow+of+tricarboxylic+acid+cycle+intermediates+is+critical+for+Mycobacterium+tuberculosis+to+establish+and+maintain+infection.">Gluconeogenic carbon flow of tricarboxylic acid cycle intermediates is critical for Mycobacterium tuberculosis to establish and maintain infection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9819-9824 (2010).</li><li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+metabolism+in+Mycobacterium+smegmatis+during+the+transition+from+O2-rich+to+O2-poor+conditions+as+studied+by+isotopomer-assisted+metabolite+analysis.">Central metabolism in Mycobacterium smegmatis during the transition from O2-rich to O2-poor conditions as studied by isotopomer-assisted metabolite analysis.</a> Biotechnol. Lett. 31, 1233-1240 (2009).</li><li>Kweon, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polyomic+approach+to+elucidate+the+fluoranthene-degradative+pathway+in+Mycobacterium+vanbaalenii+PYR-1.">A polyomic approach to elucidate the fluoranthene-degradative pathway in Mycobacterium vanbaalenii PYR-1.</a> J. Bacteriol. 189, 4635-4647 (2007).</li><li>Hasan, M. R., Rahman, M., Jaques, S., Purwantini, E., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+6-phosphate+accumulation+in+mycobacteria:+implications+for+a+novel+F420-dependent+anti-oxidant+defense+system.">Glucose 6-phosphate accumulation in mycobacteria: implications for a novel F420-dependent anti-oxidant defense system.</a> J. Biol. Chem. 285, 19135-19144 (2010).</li><li>Soga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+metabolome+analysis+using+capillary+electrophoresis+mass+spectrometry.">Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry.</a> J. Proteome Res. 2, 488-494 (2003).</li><li>Metz, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+liquid+chromatography-mass+spectrometry+(LC-MS)+in+metabolic+profiling+and+metabolomic+studies+for+biomarker+discovery.">The future of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) in metabolic profiling and metabolomic studies for biomarker discovery.</a> Biomark Med. 1, 159-185 (2007).</li><li>Ludwig, C., Viant, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+J-resolved+NMR+spectroscopy:+review+of+a+key+methodology+in+the+metabolomics+toolbox.">Two-dimensional J-resolved NMR spectroscopy: review of a key methodology in the metabolomics toolbox.</a> Phytochem. Anal. 21, 22-32 (2010).</li><li>Simpson, R. J., Inglis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual. , 425-595 (2003).</li><li>Beste, D. J., McFadden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-level+strategies+for+studying+the+metabolism+of+Mycobacterium+tuberculosis.">System-level strategies for studying the metabolism of Mycobacterium tuberculosis.</a> Mol. Biosyst. 6, 2363-2372 (2010).</li><li>Rhee, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+carbon+metabolism+in+Mycobacterium+tuberculosis:+an+unexpected+frontier.">Central carbon metabolism in Mycobacterium tuberculosis: an unexpected frontier.</a> Trends Microbiol. , (2011).</li><li>Who. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+Organization.">Health Organization.</a> Anti-tuberculosis Drug Resistance in the World: Report No. 4. , (2008).</li><li>Jassal, M., Bishai, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensively+drug-resistant+tuberculosis.">Extensively drug-resistant tuberculosis.</a> Lancet Infect Dis. 9, 19-30 (2009).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Un numero significativo di studi ha analizzato i profili di trascrittomica e proteomica di M. tubercolosi sotto una varietà di in vitro e in vivo. 11-16 definitiva, cambiamenti nell&#39;espressione genica e dell&#39;attività enzimatica portare a variazioni nella concentrazione di piccole molecole di peso molecolare. La descrizione completa di questi composti costituisce il metaboloma. Pertanto, gli effetti delle droghe e delle condizioni di crescita variabile sulle vie metaboliche...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / attrezzature </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> ADC Arricchimento </td><td> BD BBL Middlebrook </td><td> 212352 </td><td></td></tr><tr><td> BACS-120 Sample Changer </td><td> Bruker </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bruker Avance NMR </td><td> Bruker </td><td></td><td> 500 MHz </td></tr><tr><td> Albumina di siero bovino </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1600-100 </td><td> Frazione V </td></tr><tr><td> Centrifuga </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra X-15R </td><td> Da banco </td></tr><tr><td> Tubi per centrifuga </td><td> Corning </td><td> 430291 </td><td> 50 ml polipropilene sterile </td></tr><tr><td> Fiale criogeniche </td><td> Corning </td><td> 430488 </td><td> 2,0 ml in polipropilene sterile </td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> AG scientifico </td><td> C-1189 </td><td> Tossico </td></tr><tr><td> D (+) - Glucosio </td><td> ACROS </td><td> 41095-0010 </td><td></td></tr><tr><td> Ossido di deuterio </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 617385 </td><td></td></tr><tr><td> Beuta </td><td> VWR </td><td> 89095-266 </td><td> Sterile, base piatta, policarbonato, 0,22 micron membrana in PTFE tappo ventilato </td></tr><tr><td> Flash Freeze Flask </td><td> VWR </td><td> 82018-226 </td><td> 750 ml </td></tr><tr><td> Liofilizzatore </td><td> VWR </td><td> 82019-038 </td><td> 4.5 L da banco </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> GibcoBRL </td><td> 15514-029 </td><td></td></tr><tr><td> Incubatrice </td><td> Nuovo Brunswick </td><td> Innova 40 </td><td> Agitatore da banco </td></tr><tr><td> Lisi Matrix B </td><td> MP Biomedicals </td><td> 6911-100 </td><td></td></tr><tr><td> Lysis macchina </td><td> MP Biomedicals </td><td> FastPrep-24 </td><td></td></tr><tr><td> Microcentrifuga </td><td> Eppendorf </td><td> 5415D </td><td> Da banco </td></tr><tr><td> Microcentrifuga </td><td> Beckman Coulter </td><td> Microcentrifuga 22R </td><td> Da banco </td></tr><tr><td> Brodo Middlebrook 7H9 </td><td> Difco </td><td> 271310 </td><td></td></tr><tr><td> NMR tubi </td><td> Norell </td><td> ST500-7 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Arricchimento OADC </td><td> BD BBL Middlebrook </td><td> 212351 </td><td></td></tr><tr><td> Acido oleico </td><td> Sigma </td><td> O1008 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato di potassio bibasico </td><td> VWR </td><td> BDH0266 </td><td></td></tr><tr><td> Potassio fosfato monobasico </td><td> VWR </td><td> BDH0268 </td><td></td></tr><tr><td> Rotor - Microcentrifugare 22R </td><td> Beckman Coulter </td><td> F241.5P </td><td> Sigillata e polipropilene </td></tr><tr><td> Rotor - Allegra X-15R</td><td> Beckman Coulter </td><td> SX4750 </td><td> Con bio-certificati coperture </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio </td><td> Fisher Scientific </td><td> S271-3 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio-3-trimethylsilylpropionate-2 ,2,3,3-D4 </td><td> Cambridge Isotope </td><td> DLM-48 </td><td></td></tr><tr><td> Spettrofotometro </td><td> Beckman Coulter </td><td> DU-530 </td><td></td></tr><tr><td> Spettrofotometro Cuvette </td><td> Sagola di salvataggio </td><td> LS-2410 </td><td> 1,5 ml in polistirolo, 2 lati trasparenti </td></tr><tr><td> Siringa </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309585 </td><td> Sterile, 3 ml Luer-Lok </td></tr><tr><td> Siringa Filtro </td><td> Nalgene </td><td> 190-2520 </td><td> Acetato di 0,2 micron di cellulosa sterile </td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP338-500 </td><td></td></tr></tbody></table>

sample preparation of mycobacterium tuberculosis extracts for nuclear magnetic resonance metabolomic studies

Mycobacterium tuberculosis è una delle principali cause di mortalità degli esseri umani su scala globale. L&#39;emergere di due multi-(MDR) e estesamente-(XDR) ceppi farmaco-resistenti minaccia di far deragliare attuali sforzi di lotta contro la malattia. Pertanto, vi è una necessità urgente di sviluppare farmaci e vaccini che sono più efficaci di quelle attualmente disponibili. Il genoma di M. la tubercolosi è nota da più di 10 anni, ma ci sono importanti lacune nella nostra conoscenza della funzione genica e essenzialità. Molti studi hanno utilizzato da analisi di espressione genica sia a livello trascrittomica e proteomica per determinare gli effetti dei farmaci, ossidanti, e le condizioni di crescita sui modelli globali di espressione genica. In definitiva, la risposta finale di questi cambiamenti si riflette nella composizione metabolico del batterio comprendere alcune migliaia di sostanze a basso peso molecolare. Confrontando i profili metabolici di tipo selvatico e mutanti, sia trattata o treated con un particolare farmaco, può effettivamente permettere l&#39;identificazione di destinazione e può portare allo sviluppo di nuovi inibitori con attività anti-tubercolare. Analogamente, gli effetti di due o più condizioni del metaboloma può anche essere valutato. Risonanza magnetica nucleare (NMR) è una tecnologia potente che viene utilizzato per identificare e quantificare intermedi metabolici. In questo protocollo, le procedure per la preparazione di M. tubercolosi estratti cellulari per l&#39;analisi NMR metabolomica sono descritti. Colture di cellule vengono coltivate in condizioni appropriate e richiesto livello di biosicurezza 3 di contenimento 1, raccolte e sottoposte a lisi meccanica pur mantenendo basse temperature per massimizzare la conservazione dei metaboliti. Lisati cellulari sono recuperati, filtrati sterilizzato, e conservati a temperature bassissime. Aliquote di questi estratti di cellule sono piastrate su agar Middlebrook 7H9 per unità formanti colonia per verificare l&#39;assenza di cellule vitali. Su due mesi di incubazione a 37 ° C, se non vicolonie capaci si osservano, i campioni vengono rimossi dalla struttura di contenimento per il trattamento a valle. Sono estratti liofilizzati, risospese in tampone deuterato e iniettato nello strumento NMR, catturando dati spettroscopici che viene poi sottoposto ad analisi statistica. Le procedure descritte possono essere applicate sia unidimensionale (1D) 1 H NMR e bidimensionale (2D) 1 H-13 C NMR. Questa metodologia fornisce più affidabile di identificazione piccolo peso molecolare metabolita e analisi quantitative più affidabili e sensibili di composizioni estratto cellulare metaboliche rispetto ai metodi cromatografici. Variazioni della procedura descritta in seguito alla fase di lisi cellulare può anche essere adattato per parallela analisi proteomica.

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Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Il profilo metabolico di<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; È determinata dopo la crescita in colture in brodo. Le condizioni possono essere variate per testare gli effetti di integratori alimentari, ossidanti e anti-tubercolosi agenti sul profilo metabolico di questo microrganismo. Procedura per la preparazione estratto è applicabile sia per 1D<sup&gt; 1</sup&gt; H e 2D<sup&gt; 1</sup&gt; H-<sup&gt; 13</sup&gt; C NMR.

Preparazione del campione di<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Estratti di studi di risonanza magnetica nucleare metabolomica

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

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Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

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15.2K Views.  University of Nebraska-Lincoln. Il profilo metabolico di Mycobacterium tuberculosis È determinata dopo la crescita in colture in brodo. Le condizioni possono essere variate per testare gli effetti di integratori alimentari, ossidanti e anti-tubercolosi agenti sul profilo metabolico di questo microrganismo. Procedura per la preparazione estratto è applicabile sia per 1D 1 H e 2D 1 H- 13 C NMR.

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Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

Crescita Mycobacterium tuberculosis I biofilm

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

Monitoraggio migrazione delle cellule dendritiche usando<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Magnetic Resonance Imaging

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

Un modello sperimentale per studiare la tubercolosi, la malaria coinfezione sulla trasmissione naturale di Mycobacterium tuberculosis E Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

Dimostrazione di un multi-resistente ai farmaci<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Amplificazione Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

Un 3D Polmone umano tessuto modello per studi funzionali su<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infezione

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

Sistema per l&#39;efficacia e la citotossicità Proiezione di inibitori di targeting intracellulare<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Un test compatibile high-throughput per valutare Drug efficacia contro macrofagi diversi passaggi<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

Analisi di 18FDG PET/CT Imaging come strumento per studiare l'infezione di tubercolosi del micobatterio e trattamento in primati Non umani

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

Tubercolosi del micobatterio in topi con fluorescenza enzima Reporter di imaging

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

Modellazione di tubercolosi in Zebrafish adulto infettato di Mycobacterium marinum

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

Methods Article

Preparazione del campione di