Questo metodo di co-coltura aiuterà a rispondere alle domande chiave che circondano i meccanismi di contatto cellulare alla base della regolazione delle cellule staminali mesenchimali della fagocitosi dei macrofagi e quindi illuminerà il ruolo di MSC nella regolazione dell'immunità innata. Questa tecnica può essere applicata in analisi ad alto rendimento. Le bioparticelle coniugate a coloranti sensibili al pH fluoresce solo in ambienti fagolisiosomi acidi.
Quindi, il lavaggio e la tempra sono necessari. Questo metodo può anche essere applicato a una varietà di modelli di co-coltura che includono neutrofili e altri fagociti. A dimostrare la procedura sarà Ethan Chetkof, uno studente universitario attualmente nel mio laboratorio.
Per cominciare, osserva la confluenza delle cellule staminali mesenchimali in coltura. Quando si raggiunge una confluenza del 70-80%, aspirare il mezzo di crescita dalle cellule coltivate in un piatto da 100 millimetri e aggiungere cinque millilitri di PBS. Dopo aver aspirato il PBS, aggiungere due millilitri di soluzione di TRIPSINA EDTA allo 0,05% e incubare le cellule per tre minuti.
Dopo tre minuti, controllare il distacco cellulare utilizzando un microscopio invertito. E se le cellule non sono staccate, incubare di nuovo per uno o due minuti. Una volta che tutte le cellule sono staccate, aggiungere cinque millilitri di terreno di crescita fresco al piatto.
Dopo aver risciacquato la piastra utilizzando la miscela di media tripsina, utilizzare una pipetta sierologica sterile per raccogliere le cellule in un tubo conico pulito e sterile da 50 millilitro. Successivamente, pellet giù le celle per centrifugazione. Dopo aver aspirato il surnatante, risuscievole il pellet cellulare in 10 millilitri di terreno di coltura fresco tubando delicatamente su e giù.
Per il conteggio delle cellule, aggiungere 10 microlitri di sospensione cellulare in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente 30 microlitri di soluzione di Trypan Blue allo 0,4%, quindi aggiungere 10 microlitri della miscela sotto il coperchio di una camera di conteggio dell'emocitometro. Sotto il microscopio invertito o Brightfield, contare le cellule vitali non macchiate usando una lente obiettivo 10X e quattro camere millimetriche di un quadrato e calcolare il numero di cellule come descritto nel manoscritto di testo. Utilizzare l'equazione C1V1 uguale a C2V2 per determinare il volume desiderato del mezzo fresco e della sospensione cellulare necessaria per preparare la sospensione cellulare a una concentrazione finale di una volta 10 alla quinta cella per millilitro.
Utilizzare un micropipetter multicanale per aggiungere 100 microlitri della sospensione cellulare nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti in base al design della piastra. Utilizzare una micropipetta per aggiungere 530 microlitri della sospensione cellulare a ciascuno dei vetrini della camera in base al design della piastra e incubare durante la notte. Preparare 10 millilitri di mezzo di attivazione contenente interferone gamma ad una concentrazione di 250 nanogrammi per millilitro per attivare le cellule macrofagiche in un piatto da 100 millimetri.
Aspirare il mezzo di crescita dalle colture cellulari dei macrofagi e risciacquare le cellule con cinque millilitri del mezzo di attivazione privo di interferone gamma. Dopo aver aspirato il mezzo di risciacquo nel piatto sperimentale, aggiungere 10 millilitri di mezzo di attivazione integrato con interferone gamma. E nella parabola di controllo, aggiungere 10 millilitri di mezzo di attivazione senza interferone gamma, quindi incubare le cellule per 16-24 ore.
Alla fine dell'incubazione, per preparare le co-colture, rimuovere il mezzo di attivazione dalle cellule dei macrofagi e aggiungere cinque millilitri di terreno di crescita fresco. Utilizzare un sollevatore di celle per raschiare delicatamente le cellule e raccogliere le cellule in un tubo conico da 50 millilitro. Successivamente, contare le cellule utilizzando l'esclusione e l'emocitometria di Trypan Blue, seguite dalla preparazione di sospensioni di cellule macrofagiche di controllo e trattate alla concentrazione di due volte 10 alla quinta cellula per millilitro come dimostrato in precedenza per le cellule staminali mesenchimali.
Aspirare delicatamente il mezzo dai pozzi sperimentali contenenti cellule staminali mesenchimali. Utilizzare una micropipetta multicanale per aggiungere 100 microlitri delle sospensioni cellulari macrofagiche trattate e di controllo nei pozzetti sperimentali appropriati secondo il design della piastra e incubare durante la notte come dimostrato. Aspirare delicatamente il mezzo dal vetrino a camera a quattro pareti contenente cellule staminali mesenchimali.
Utilizzare una micropipetta per aggiungere 530 microlitri della sospensione cellulare dei macrofagi ai pozzeggi appropriati in base al design e incubare durante la notte. Aggiungere un millilitro di mezzo di imaging a cellule vive al flaconcino contenente un milligrammo di particelle Zymosan e raccogliere la miscela di particelle medie in un tubo di coltura di vetro. Dopo aver risciacquato il flaconcino con un ulteriore millilitro di soluzione di imaging, trasferire il mezzo di imaging risciacquato nel tubo di vetro, quindi aggiungere tre millilitri di soluzione di imaging aggiuntiva per ottenere 0,2 milligrammi per millilitro di sospensione di particelle Zymosan.
Vortex la sospensione Zymosan utilizzando impulsi rapidi per 30-60 secondi, quindi utilizzare un sonicatore a sonda per sonicare la sospensione con 60 impulsi rapidi. Dopo aver aspirato il mezzo, risciacquare i pozzi sperimentali e i pozzi vuoti reagenti con 100 microlitri di soluzione di imaging a cellule vive. Quindi, aspirare la soluzione di imaging a cellule vive dai pozzi e aggiungere 100 microlitri della sospensione di Zymosan.
Aprire il vassoio della piastra del lettore fluorescente utilizzando l'interfaccia touch pad. Impostare la piastra senza coperchio nel vassoio con il pozzetti A1 nell'angolo in alto a sinistra. Chiudi il vassoio usando il touch pad e fai clic sul pulsante di lettura verde nel menu in alto.
Per condurre il test di fagocitosi, dopo aver risciacquato il primo pozzo sperimentale con 750 microlitri del mezzo di imaging, aggiungere 400 microlitri della sospensione di Zymosan lasciando i restanti pozzi nel terreno di crescita. Quindi, posizionare la diapositiva sullo stadio incubato del sistema di imaging. Utilizzare il software di imaging.
Selezionare l'opzione Brightfield nella scheda Individua, quindi fare clic sull'icona dell'oculare. Con l'obiettivo 10X in posizione, utilizzare l'oculare e la manopola di messa a fuoco per mettere a fuoco le cellule. Selezionare la scheda acquisizione.
Apri il menu a discesa dell'esperimento e seleziona una serie di lunghezze d'onda che include il set di filtri EGFP per ospitare l'eccitazione di 509 nanometri e le lunghezze d'onda di emissione di 533 nanometri del colorante sensibile al pH. Quando rimangono circa due minuti sul timer, fare clic sull'icona 20X nel menu obiettivo per cambiare l'obiettivo in 20X, quindi fare clic sul menu dei canali, selezionare filtri EGFP e, nel menu di esposizione, impostare il tempo di esposizione su 400 millisecondi per rilevare il fluoroforo verde sensibile al pH, quindi fare clic su live. Dopo aver regolato la messa a fuoco, fare clic su Stop per spegnere la luce e selezionare la casella accanto all'impostazione sperimentale time-lapse superiore.
Nel menu della strategia di messa a fuoco, selezionare la messa a fuoco automatica del software e dal menu a discesa, selezionare le impostazioni smart e core per ridurre il tempo di esposizione alla luce mentre la messa a fuoco automatica è in esecuzione. Nel menu time-lapse, impostare il numero desiderato di acquisizioni su 30 a 60, il tempo di intervallo su un minuto, quindi fare clic sul pulsante Avvia esperimento per iniziare l'acquisizione. È stato studiato l'effetto dell'interferone gamma sulla co-coltura.
I risultati rappresentativi dimostrano che la co-coltura di macrofagi con cellule staminali mesenchimali migliora l'attività fagocitica del macrofago. Il trattamento con interferone gamma riduce l'attività del macrofago. Tuttavia, in presenza di cellule staminali mesenchimali, l'attività fagocitica dei macrofagi è stata parzialmente salvata.
Le densità cellulari ottimali sono fondamentali in questi studi. E quando le cellule dei macrofagi sono state placcate a una densità troppo bassa, non sono stati rilevati cambiamenti nell'intensità della fluorescenza. Quando le cellule dei macrofagi sono state placcate ad alta densità, l'intensità della fluorescenza è stata elevata rapidamente in tutti i gruppi e le differenze non sono state individuate.
Una delle cose più importanti durante questa procedura è garantire che le densità cellulari siano ottimizzate e mantenute coerenti tra gli esperimenti.
