Estrazione del cofattore _F420 per l'analisi della lunghezza della coda di poliglutammato da colture pure metanogeniche e campioni ambientali

Il cofattore F420 svolge un ruolo importante nel metabolismo primario e secondario di molti procarioti. La misurazione di questa molecola in campioni ambientali consente una comprensione più profonda della sua prevalenza e funzione. Questa tecnica consente l'analisi del cofattore in materiali campione difficili come fanghi e terreno.

In tal modo la lisi del materiale e la pre-purificazione prima dell'analisi sono i passaggi centrali. Il protocollo include diversi passaggi durante la preparazione del campione. Questi passaggi devono essere pianificati e preparati molto bene prima di iniziare con l'elaborazione del campione.

Ad esempio, la preparazione di tamponi freschi è importante. Per iniziare la lisi del campione, posizionare cinque grammi del campione in un tubo conico da 50 millilitri. Quindi aggiungere cinque millilitri di tampone di lisi 2X ai campioni e portare il volume a 10 millilitri con acqua distillata per raggiungere una concentrazione finale di 0,5 grammi per millilitro.

Vortice dei campioni diluiti per 20 secondi seguiti da autoclave per 30 minuti a 121 gradi Celsius. Per i campioni secchi come il suolo forestale, portare a un volume finale di 20 millilitri con acqua distillata dopo l'autoclave e ruotare nuovamente il campione diluito per 20 secondi, come dimostrato. Una volta che i campioni si raffreddano, centrifugare il lisato del campione per cinque minuti a 11.000 x g e raccogliere il surnatante.

Preparare un'estrazione in fase solida di cinque millilitri o una colonna SPE riempita con 100 milligrammi di assorbente polimerico in modalità mista ad anione debole condizionando lo scambiatore di anioni con tre millilitri di metanolo. Quindi, equilibrare lo scambiatore di anioni con tre millilitri di acqua distillata. Caricare fino a nove millilitri del surnatante dal lisato centrifugato sulla colonna SPE.

Lavare sequenzialmente le impurità dalla colonna con cinque millilitri di acetato di ammoniaca da 25 millimolari e cinque millilitri di metanolo. Dopo il lavaggio, eluire il cofattore F420 con un millilitro di tampone di eluizione. Preimpostare il forno a 40 gradi Celsius e impostare il rilevatore di fluorescenza su 420 nanometri di lunghezza d'onda di estinzione e 470 nanometri di lunghezza d'onda di emissione.

Quindi, filtrare il campione eluito dall'SPE in flaconcini HPLC utilizzando un filtro PTFE con una dimensione dei pori di 0,22 micron. Iniettare 50 microlitri del campione filtrato nel sistema HPLC e separare il cofattore F420 tramite la modalità gradiente utilizzando una combinazione di fasi mobili come descritto nel manoscritto. Analizzare la composizione e la concentrazione del cofattore F420.

La crescita di colture pure di metanogeni è stata verificata al microscopio. Nella microscopia a contrasto di fase, sono visibili agglomerati di metanogeni, che emettono una luce bluastra quando il cofattore F420 è eccitato con luce ultravioletta. È stata analizzata l'area di picco del cofattore recuperato F420 dopo SPE con diversi volumi delle colture di Methanoculleus thermophilus.

La strategia di disintegrazione in autoclave ha raggiunto l'area di picco più elevata, concludendo la massima efficienza di estrazione utilizzando un trattamento pressione-temperatura. L'analisi della distribuzione della lunghezza della coda ha rivelato le differenze nella concentrazione complessiva del cofattore F420 e nella distribuzione della lunghezza della coda F420 delle colture metanogeniche pure nei campioni ambientali. Quando si applica questa procedura, tenere presente di raccogliere completamente il volume totale del tampone di eluizione o registrare il volume esatto del flusso attraverso.

Questa tecnica apre la strada all'esplorazione del cofattore F420 in campioni più complessi come terreni e fanghi e consente di approfondire l'impatto ecologico di questa molecola.