Questo protocollo analizza le singole proprietà meccaniche del nucleo cellulare che lo rendono un misuratore meccanico per la polarizzazione, la differenziazione e la migrazione cellulare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può misurare le proprietà meccaniche e applicare forze ai compartimenti subcellulari senza perturbazione esterna della membrana o del citoscheletro corticale. Il protocollo può essere facilmente adattato per manipolare perline all'interno di altre cellule di altri organismi al fine di studiare la meccanica nucleare in diverse linee cellulari o modelli animali.
L'allineamento del sensore di forza diretta è fondamentale per catturare tutta la luce che crea e lascia le trappole ottiche. Ciò garantirà misurazioni accurate del momento luminoso nel mezzo viscoelastico di una cellula. Inizia la preparazione unicellulare posizionando gli embrioni allo stadio della sfera quattro ore dopo la fecondazione in un piatto di vetro contenente supporti E3 usando una pipetta di plastica Pasteur.
Quindi selezionare gli embrioni che sono positivi alle perle ed esprimere la proteina fluorescente in caso di iniezione di mRNA. Utilizzare una pinza per decurionare manualmente gli embrioni e trasferire circa 10-15 embrioni decurionati in un contenitore di reazione da 1,5 millilitri con l'aiuto di una pipetta di vetro Pasteur. Rimuovere il fluido E3 dal tubo e aggiungere 500 microlitri di terreno di coltura tissutale preriscaldato indipendente dall'anidride carbonica.
Agitare delicatamente il tubo evitando la formazione di bolle e assicurarsi che il contenuto del tubo diventi torbido mentre le cellule si dissociano senza grossi pezzi visibili dall'occhio. Quindi centrifugare il tubo a 200 volte G per tre minuti. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e raccogliere il pellet per procedere con la colorazione cellulare.
Per etichettare il nucleo, risospese le cellule aggiungendo 500 microlitri della soluzione colorante DNA Hoechst appena preparata al tubo. Incubare le cellule colorate per sette minuti al buio. Successivamente, centrifugare le cellule come descritto in precedenza e risospescere il pellet in 50 microlitri di DMEM per i campioni in sospensione o 20 microlitri di DMEM per le cellule in confinamento.
Per la preparazione degli orpelli ottici o della camera OT per gli esperimenti con le celle in sospensione, tagliare un pezzo di scotch biadesivo con un foro quadrato di circa 10 millimetri per 10 millimetri al centro. Staccare uno degli strati protettivi del nastro e posizionare il lato scoperto del nastro al centro di un piatto con fondo di vetro numero 1,5 H. Premere delicatamente il nastro per far aderire tutta la superficie del nastro al vetro evitando bolle d'aria e staccare lo strato protettivo rimanente del nastro.
Incubare la superficie con 100 microlitri di Concanavalin A a 0,5 milligrammi per millilitro per 30 minuti. Quindi rimuovere la goccia di Concanavalin A e risciacquare la superficie con DMEM. Aggiungere 30 microlitri della soluzione contenente le cellule sulla superficie della cavità.
Quindi chiudere la camera molto delicatamente con un vetro di copertura da 22 per 22 millimetri. Utilizzare un bisturi o una pinza, se necessario. Successivamente, procedere all'avvio delle pinzette ottiche accendendo il laser ad altissima potenza per almeno 30 minuti prima dell'esperimento per ottimizzare la stabilità della potenza di uscita.
Al termine, accendere il modulo elettronico delle micro manipolazioni ottiche e delle unità di misurazione della forza. Prima di allineare il sensore di forza ottica, posizionare una goccia d'acqua sull'obiettivo di immersione in acqua 60X 1.2 e posizionare la camera contenente le celle sul palco. Concentrati sulla superficie inferiore della camera in cui verranno posizionati i campioni cellulari.
Dopo aver aggiunto una goccia di olio per immersione sulla parte superiore del vetrino di copertura che copre il campione, abbassare la lente di raccolta dell'unità sensore di forza fino a quando non contatta la goccia d'olio. Seguendo la procedura standard per l'allineamento del sensore di forza ottica, guardare l'immagine del piano campione sulla telecamera ausiliaria da utilizzare per posizionare gli OT, quindi abbassare il sensore di forza ottica fino a quando il suo arresto del campo appare coniugato sul piano del campione. Per verificare la presenza di bolle d'aria con l'obiettivo Bertrand, osservare il percorso di imaging attraverso la fotocamera ausiliaria.
Se sono visibili sporcizia o bolle d'aria, pulire la lente e la camera con tessuto privo di polvere prima di ripetere la procedura come descritto, aggiungendo altro olio per immersione. Utilizzando le viti laterali posizionate sul supporto del sensore di forza ottica, centrare l'arresto del campo nel campo visivo. Per precisione, aprire l'arresto del campo quasi per occupare il campo visivo visibile sulla telecamera ausiliaria.
Dopo aver posizionato il campione al microscopio e allineato il sensore di forza ottica, utilizzare la piastra rotante a mezza onda per impostare la potenza di trappola iniziale a 200 milliwatt se la rigidità del nucleo o della struttura intercellulare studiata non è nota. Una volta fatto, utilizzare il controller software dello stadio del microscopio per cercare una cellula con una o due perline attraverso la microscopia Brightfield trasmessa. Nel foglio numerico, scrivi lo spostamento e il tempo di ogni passo successivo della traiettoria.
In alternativa, caricare la tabella S1 dal materiale supplementare. Per un esperimento di stress/rilassamento, programmare i carichi trapezoidali da applicare. Nel software OT, attivare le trappole ottiche.
Per intrappolare una microsfera, impostare i piani dell'immagine leggermente sopra il tallone con un controller software per lo stadio del microscopio. Fare clic sulla microperla di polistirene nella finestra di imaging della telecamera ausiliaria calibrata. Il confinamento riuscito del tallone da parte della trappola ottica ridurrà fortemente il movimento del tallone.
Fare clic e trascinare il tallone attraverso il citoplasma e posizionarlo a una distanza di circa due micron dall'involucro nucleare. Assicurarsi che la traiettoria sia impostata in modo che la rientranza del tallone sia perpendicolare alla membrana nucleare. Quando la configurazione è pronta, vai al software di imaging e fai clic sul pulsante di acquisizione per avviare l'acquisizione delle immagini.
Apri la finestra di lettura forzata in tempo reale, fai clic sui dati e salva nella finestra di lettura della forza in tempo reale per salvare. Avviare i dati di misurazione della posizione di trappola e della forza. Avviate la traiettoria caricata in precedenza facendo clic con il pulsante destro del mouse sul tallone e selezionando la traiettoria iniziale.
Attendere che la traiettoria sia terminata e che il sistema si stabilizzi prima di terminare la registrazione dei dati di misurazione della forza della trappola. Interrompere l'acquisizione delle immagini e tracciare i risultati nel software di post-elaborazione. Nell'analisi rappresentativa, viene visualizzata una cellula staminale progenitrice di zebrafish isolata con una singola microsfera vicino al nucleo.
È stata monitorata la distribuzione della microsfera di polistirene cinque ore dopo l'iniezione all'interno di un embrione. L'immagine del campo luminoso e della fluorescenza mostra che le perline sono disperse nel tessuto embrionale. La massima proiezione dello Z-stack fluorescente confocale e una proiezione massima di un sotto-stack nella stessa regione confermano che una grande frazione di celle profonde conteneva da una a due perline.
A 24 ore dalla fecondazione, le perle sono state distribuite su tutto il corpo dell'embrione. Sono state ottenute le micrografie Brightfield delle cellule in sospensione sulle cellule confinate con una o due perle iniettate. Inoltre, più etichette fluorescenti hanno facilitato lo studio di diversi aspetti delle cellule, come la membrana internucleare, la membrana plasmatica, il DNA e la linea transgenica.
Le istantanee rappresentative hanno descritto nuclei marcati con Hoechst cinque secondi prima /durante e cinque secondi dopo l'indentazione con una microsfera intrappolata otticamente. Sono stati studiati profili di intensità lungo il segmento di rientranza per tre diversi fotogrammi e traiettorie dei confini distali e prossimali del nucleo durante un esperimento di rientranza di cellule sospese e confinate. Sono state misurate la traiettoria intrappolata e la forza sperimentata dalla microsfera intrappolata otticamente durante un ripetuto esperimento di rientranza nucleare.
La meccanica del nucleo nelle cellule in sospensione e sotto confinamento ha confermato che il confinamento ha comportato un'espansione dell'area proiettata e un cambiamento insignificante nella rigidità nucleare. Se le perline vengono iniettate nell'embrione di una cellula, molto probabilmente si distribuiranno uniformemente nelle fasi successive. Ricorda che il tallone deve essere stabilmente intrappolato.
Se il tallone sfugge alla trappola ottica, ridefinire la traiettoria o aumentare la potenza del laser. Questi esperimenti possono essere facilmente eseguiti su più microsfere all'interno di una cellula ed estesi a misurazioni microreologiche attive.
