Il metodo di autoinduzione senza cellule riduce la supervisione dei ricercatori e il tempo necessario per produrre estratti di cellule funzionali. Ciò semplifica i precedenti protocolli di sintesi proteica in vitro che erano più dispendiosi in termini di tempo e intensivi. Questa tecnica è meno complicata e anche ad alto rendimento, il che consentirà a un pubblico più ampio di implementare l'espressione senza cellule.
Questo metodo evidenzia l'importanza del metabolismo energetico durante la crescita cellulare e all'interno delle reazioni prive di cellule. Inizia preparando 960 millilitri di mezzi di autoinduzione senza cellule. Quindi, sterilizzare il fluido in un pallone sconcertato da 2,5 litri mediante autoclave per 30 minuti a 121 gradi Celsius.
Successivamente, dopo aver preparato 40 millilitri della soluzione zuccherina, sterilizzarla con filtro in un contenitore di vetro autoclavato separato. Dopo l'autoclave, quando il terreno di coltura si è raffreddato a meno di 40 gradi Celsius, aggiungere la soluzione zuccherina sterilizzata con filtro direttamente al supporto. Quindi, inoculare il mezzo facendo scorrere un anello pieno di colonie da una piastra stellare E.coli BL21 fresca precedentemente striata e inserendo il loop direttamente nel supporto.
Ruotare il loop nel supporto senza toccare i lati del contenitore. Quindi, posizionare il supporto inoculato durante la notte in un'incubatrice a 30 gradi Celsius con agitazione a 200 RPM. Il giorno successivo, raccogliere le cellule trasferendo un litro del supporto in una bottiglia di centrifuga da un litro e centrifugando a 5.000 volte G tra quattro e 10 gradi Celsius per 10 minuti.
Dopo aver scartato il surnatante, utilizzare una spatola sterile per trasferire il pellet in un tubo conico da 50 millilitri pre-refrigerato e precedentemente pesato. Quindi, lavare il pellet una volta con 30-40 millilitri di tampone S30 freddo risospendendo il pellet tramite vortice in raffiche di 30 secondi con periodi di riposo sul ghiaccio. Dopo che il pellet è stato completamente risospeso, centrifugare la risospensione cellulare, scartare il surnatante e, utilizzando un tessuto pulito, pulire qualsiasi surnatante in eccesso dalle pareti interne del tubo da 50 millilitri senza toccare il pellet.
Quindi, pesare il pellet prima di congelarlo in azoto liquido e conservarlo a meno 80 gradi Celsius fino a un ulteriore utilizzo. Per preparare l'estratto cellulare, aggiungere un millilitro di tampone S30 per grammo del pellet cellulare congelato e lasciare che il pellet si scongeli sul ghiaccio per 30-60 minuti. Quindi, risospese il pellet scongelato tramite vortice in raffiche di 30 secondi con periodi di riposo sul ghiaccio fino a quando non rimangono grumi cellulari visibili.
Per la lisi cellulare, trasferire aliquote da 1,4 millilitri della sospensione cellulare in tubi di microfuga da 1,5 millilitri. Quindi, sonicare la sospensione cellulare in ciascun tubo con una frequenza di 20 kilohertz e un'ampiezza del 50% per tre raffiche di 45 secondi con 59 secondi di riposo per ciclo in un bagno di ghiaccio Invertire il tubo tra i cicli e, dopo l'ultimo ciclo di sonicazione, aggiungere immediatamente 4,5 microlitri di ditiotreitolo monofusolare. Dopo aver sonicato la sospensione cellulare in tutti i tubi, centrifugare i tubi e raccogliere il surnatante in aliquote da 600 microlitri in tubi di microfuga freschi da 1,5 millilitri.
Congelamento flash e conservare le aliquote a meno 80 gradi Celsius fino a nuovo utilizzo. Per eseguire 15 microlitri di reazione di sintesi proteica senza cellule in tubi di microfuga da 1,5 millilitri in quadruplicato, scongelare un'aliquota dell'estratto cellulare. Dopo aver preparato ogni miscela di reazione a 15 microlitri, lasciare che la reazione funzioni per almeno quattro ore a 37 gradi Celsius.
Per quantificare la proteina reporter, combinare 48 microlitri di tampone HEPES da 50 millimolari a pH 7,2 con due microlitri di ciascun prodotto di reazione di sintesi proteica privo di cellule in una piastra di polistirene nero a 96 pozzetti. Quantificare l'intensità di fluorescenza della proteina fluorescente verde superfolder, o sfGFP, utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 485 e una lunghezza d'onda di emissione di 528 nanometri. Quindi, convertire le unità di fluorescenza relative alla resa volumetrica di sfGFP creando una curva standard utilizzando il plasmide pJL1 sfGFP purificato.
Qui sono mostrati i pellet di fluidi di autoinduzione senza cellule dopo la raccolta delle cellule a diverse densità ottiche misurate a 600 nanometri. Il supporto cresciuto fino a una densità ottica di 10 ha prodotto una quantità maggiore di pellet cellulare nell'estratto complessivo rispetto al mezzo cresciuto fino a una densità ottica di 2,5. Un'ulteriore analisi della concentrazione totale di proteine non ha dimostrato alcuna differenza significativa nella proteina complessiva tra i due estratti.
Anche se il mezzo è stato coltivato a diversi livelli di densità ottica, entrambi gli estratti hanno dimostrato risultati simili in reazioni prive di cellule che esprimono sfGFP. Mantenere condizioni sterili durante la preparazione del mezzo e della soluzione di zucchero è importante. Questo metodo di estrazione cellulare CFAI può essere utilizzato per la maggior parte delle applicazioni di espressione senza cellule.
Questi vanno dall'educazione biotecnologica all'ingegneria proteica, nonché alla diagnostica point-of-care. Questo metodo riduce la quantità di tempo e abilità tecnica richiesta, migliora la riproducibilità e produce maggiori quantità di estratto.
