Il nostro protocollo per l'espressione proteica priva di cellule utilizza estratto grezzo altamente attivo dal batterio Vibrio natriegens in rapida crescita, che viene preparato utilizzando un processo di sonicazione-centrifugazione in due fasi semplice ed efficiente in termini di tempo. La preparazione dell'estratto di cellule grezze e la sintesi proteica priva di cellule possono essere ottenute in uno o due giorni da un singolo utente consentendo a questa tecnica di essere facilmente integrata nelle tubazioni per applicazioni di bioproduzione o biologia sintetica. Per iniziare a lavare un millilitro della coltura natriegens Vibrio durante la notte centrifugandolo in una centrifuga da banco a 10.600 volte g per un minuto.
Aspirare il supernatante senza disturbare il pellet e rimescolare in un millilitro di supporti LB-V2 freschi. Inoculare un millilitro di coltura notturna lavata in un litro di mezzi di crescita LB-V2 freschi in un pallone Erlenmeyer sconcertato da quattro litri autoclavato con copertura sterile per ottenere una-a-mille razione di diluizione. Coltiva la cultura a 30 gradi Celsius mentre tremi a 225 giri/min.
Utilizzare uno spettrofotometro per monitorare le impostazioni cultura OD 600. E quando raggiunge 1,0 più o meno 0,2 raccolgono la coltura centrifugandola in due tubi da 500 millilitri a 3.500 volte g per 20 minuti a quattro gradi Celsius, e poi vengono posizionare sul ghiaccio. Aspirare il supernatante ed elaborare immediatamente il pellet.
Prima di iniziare la procedura di lisi cellulare raffreddare tampone di lisi S30 appena preparato pH da 7,7 a circa quattro gradi Celsius, utilizzare 10 millilitri di questo tampone di lisi S30 freddo per sospendere di nuovo tutti i pellet risultanti dalla stessa coltura di un litro. E trasferire la sospensione su un tubo da 50 millilitri. Centrifugare questa sospensione a 3.500 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius, quindi aspirare il supernatante senza disturbare il pellet e posizionare sul ghiaccio.
Lavorando in una stanza fredda aggiungere 500 microlitri di tampone freddo di llisi S30 al pellet nel tubo da 50 millilitri posto sul ghiaccio. Utilizzare una punta di pipetta a foro largo per rimescolare il pellet e trasferirlo con cura in un tubo da due millilitri anche sul ghiaccio. Per produrre estratti grezzi molto attivi dobbiamo assicurarci che le cellule non siano troppo diluite con tampone S30, ma abbiano abbastanza liquido per una sonicazione efficiente.
Riempire un becher da 600 millilitri con ghiaccio e posizionare un portatubi da due millilitri sopra il ghiaccio. Vortice il tubo brevemente per omogeneizzare le cellule. Scorrere per rimuovere eventuali celle sul fondo del cappuccio e posizionarlo nel supporto del tubo con il cappuccio aperto.
La punta del sonicatore inferiore nella sospensione cellulare nel tubo in modo che sia appena sotto la superficie liquida. Preparare il set-up di sonicazione utilizzando un sonicatore e una sonda con un diametro della punta di 1/8 pollice. Impostare il sonicatore a una frequenza di 20 kilohertz e al 50% di ampiezza.
Tempo di pulse-on di 10 secondi e tempo di pulse-off di 60 secondi. Eseguire il protocollo di sonicazione degli impulsi per tre cicli. E poi centrifugare l'estratto di cellule grezze a 16.000 volte g per 30-45 minuti a quattro gradi Celsius fino a quando il lisato non è privo di detriti cellulari.
Ispezionare visivamente la lisi cellulare man mano che avviene la sonicazione è fondamentale per garantire che la sonicazione abbia funzionato come previsto. Lavorando in una stanza fredda aliquota 50 microlitri dei supernatanti risultanti a nuovi tubi da due millilitri assicurandosi di non disturbare il pellet. Per congelare flash questi estratti di cellule grezze posizionare i tubi in un portatubi con una corda di immersione attaccata e immergersi in una dewar contenente azoto liquido e verificare se congelati.
Per eseguire l'espressione proteica priva di cellule utilizzando il modello dna scongelare il mix principale di soluzioni energetiche 10X, le aliquote del mix principale di amminoacidi 4X e il modello di DNA a temperatura ambiente. Quindi rimuovere le scorte di inibitori della T7 RNA polimerasi e della RNAse dal congelatore meno 20 gradi Celsius e posizionare sul ghiaccio. Una volta che il modello di DNA, 10X energy solution master mix e 4X aminoacido master mix vengono scongelati, posizionare sul ghiaccio.
Preparare un mix di master di reazione privo di cellule aggiungendo ogni componente nell'ordine accurato a un tubo da due millilitri sul ghiaccio e scorrere delicatamente il tubo dopo ogni aggiunta alla miscela principale. Rimuovere il lysato di cellule grezze Vibrio natriegens dal congelatore meno 80 gradi Celsius e posizionare sul ghiaccio per 10-20 minuti fino allo scongelamento. Aggiungere il volume appropriato dell'estratto di cella grezza scongelato alla miscela master di reazione priva di celle e mescolare delicatamente utilizzando una pipetta.
Per eseguire l'espressione proteica priva di cellule endpoint utilizzando il termociclometro, aggiungere prima 10 microlitri del mix master di reazione privo di cellule per pozzetto del fondo di una piastra PCR da 96 pozzetti assicurandosi di mescolare il mix principale facendo scorrere delicatamente il tubo tra ogni trasferimento sulla piastra PCR. Centrifugare la piastra a 1.000 volte g per 10 secondi per mettere in comune qualsiasi mix principale che potrebbe essere stato attaccato ai lati dei pozzi. E poi sigillare i pozzi con un adesivo a piastre per evitare l'evaporazione.
Posizionare la piastra in un termociclo impostato a 26 gradi Celsius con un coperchio riscaldato impostato a 105 gradi Celsius. Dopo aver incubato le reazioni nella piastra PCR per un minimo di tre ore, le proteine espresse possono essere purificate, quantificate e utilizzate per i processi a valle. Per monitorare la cinetica di espressione proteica priva di cellule utilizzando una pipetta lettore di lastre 10 microlitri per pozzo del mix master di reazione privo di cellule sul fondo di una piastra di dosaggio nera da 384 po 'con fondi di vetro trasparente.
E sigillare i pozzi con un adesivo a piastra chiara per evitare l'evaporazione. Posizionare la piastra di dosaggio in un lettore di lastre impostato a 26 gradi Celsius e incubare per tre o sei ore monitorando le lunghezze d'onda di eccitazione/emissione fluorescenti appropriate corrispondenti alla proteina espressa. Il sistema di espressione senza cellule descritto in questo protocollo ottiene i migliori risultati con il modello di DNA plasmide che produce una quantità significativamente maggiore di proteine rispetto alla stessa quantità di DNA lineare mostrata dai test endpoint e cinetici.
l'mRNA generato da reazioni di trascrizione in vitro potrebbe anche essere usato, ma sono necessarie quantità più elevate di mRNA. La resa della produzione proteica è stata significativamente influenzata dalla concentrazione di ioni di magnesio e potassio. In condizioni ottimizzate la concentrazione ottimale di ioni di magnesio è stata trovata di 3,5 millimolare e per lo ione potassio 80 millimolare.
Pertanto, le deviazioni da queste concentrazioni ottimali di ioni possono comportare una minore capacità di questo sistema di espressione di produrre rese significative di proteine. È importante mantenere tutti i reagenti sul ghiaccio o lavorare in una stanza fredda il più possibile. Inoltre, una sonicazione corretta e completa è fondamentale per il successo di questo protocollo.
Seguendo questo protocollo gli utenti avranno la capacità di esprimere proteine in un formato ad alta produttività, che può essere utilizzato per purificare e schermare per l'attività di molte proteine diverse. Questa tecnica dimostra l'uso di nuovi organismi con proprietà uniche per l'espressione libera dalle cellule. Vibrio natriegens è un batterio a crescita rapida alofilo che può offrire condizioni uniche per l'espressione di proteine o piccole molecole precedentemente inesplorate in organismi modello consolidati.
