Gli sferoidi a cellule di cancro al seno qui descritti consentiranno ai ricercatori di studiare i meccanismi molecolari delle interazioni delle cellule endoteliali delle cellule tumorali che sono coinvolte nella proliferazione e nelle metastasi delle cellule tumorali. Il vantaggio principale di questo modello 3D è che fornisce una disposizione cellulare più realistica che migliora l'affidabilità delle inferenze riguardanti la fisiopatologia e il trattamento del cancro al seno. A dimostrare la procedura sarà Giovanna Azzarito, dottoranda del mio laboratorio.
Iniziare trattando o trasfezionando le cellule placcate per 24 ore o come desiderato. Per identificare la distribuzione cellulare nello sferoide, lavare le cellule con un millilitro di Hanks'Balanced Salt Solution o HBSS, contenente calcio e magnesio e rimanere in HUVEC usando 0,5 microgrammi per millilitro colorante blu. E le cellule MCF-7 utilizzano 0,5 coloranti verdi micromolari diluiti nel rispetto del mezzo di crescita.
Posizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius e cinque percento di CO2 per 30-40 minuti. Lavare le cellule con un millilitro di HBSS senza calcio e magnesio. Quindi aggiungere un millilitro di ri-agente di distacco enzimatico, che è lo 0,25% di tripsina per HUVEC e lo 0,5% di viaggi in quattro MCF-7 a ciascun piatto marrone usando una pipetta P1000.
Eleggere ciascun tipo di cellula separatamente in un tubo di polistirene a fondo tondo da cinque millilitri e aggiungere un millilitro di siero per vitello fetale al 10% o mezzo FCS usando una pipetta P1000 per fermare la reazione enzimatica. Quindi centrifugare le sospensioni cellulari a 250 volte G per cinque minuti. Aspirare accuratamente il surnatante e sospendere le cellule in un millilitro di mezzo privo di steroidi.
Utilizzare 100 microlitri di ogni sospensione cellulare diluita con 10 millilitri di diluente 2 per determinare il numero totale di cellule. Accendere la macchina e lavare premendo i pulsanti funzione e di avvio, con la soluzione di Diluent 2 in un flaconcino del contatore cellulare. Utilizzare set up come quattro e premere start per misurare lo spazio vuoto con una soluzione fresca di Diluent 2.
Cambiare il flaconcino di scintillazione con 100 microlitri di sospensione cellulare in 10 millilitri di soluzione di Diluente 2. Utilizzare imposta come quattro e premere start per misurare i campioni. Notare il numero di celle per millilitro sul display digitale, quindi preparare cinque millilitri di ciascuna sospensione cellulare e mescolarli per ottenere un volume finale di 10 millilitri in un rapporto uno a uno, utilizzando la pipetta a ripetizione manuale per pipettare 100 microlitri della sospensione cellulare in ciascun pozzetto della piastra inferiore a U a 96 pozzetti.
Posizionare la piastra in un'incubatrice in condizioni standard di coltura tissutale e verificare la presenza di una formazione di sferoidi dopo 48 ore. Scatta foto di questi sferoidi con ingrandimento 40 X usando uno stereomicroscopio a contrasto di fase o a fluorescenza. Per preparare la coltura a goccia sospesa mescolare le sospensioni cellulari in un rapporto uno-a-uno per ottenere un volume finale di due millilitri.
Utilizzare una pipetta P20 per vedere la miscela cellulare sotto forma di gocce di microlitro 15 sul piombo invertito di una capsula di Petri di 10 centimetri. Capovolgere il coperchio con le gocce e aggiungere cinque millilitri di EBM-2 base medium sul fondo del piatto per evitare l'evaporazione delle gocce. Raccogliere circa 50 sferoidi in un tubo da 1,5 millilitri con una punta intestinale di una pipetta di microlitri P200.
Lasciare che si depositino sul fondo del tubo per gravità e quindi scartare il surnatante. Fissare questi sferoidi con 500 microlitri di 4% PFA per un'ora a temperatura ambiente. Far bollire il 2% della soluzione Nobel Algor in PBS usando una piastra calda con una mescola magnetica per tre-cinque minuti per sciogliere completamente la polvere di auguri e raffreddarla a circa 60 gradi Celsius.
Rimuovere il PFA con una pipetta P1000, lavare questi sferoidi con 500 microlitri di PBS e lasciarli sedimentare. Una volta sistemato, scartare con cura il surnatante pipettare 600 microlitri della soluzione di Agora nel tubo da 1,5 millilitri con sferoidi e posizionare immediatamente il tubo in una centrifuga con rotore orizzontale a 177 volte G per due minuti. Aggiungere una stringa corta al centro della soluzione Agro per rimuovere facilmente la spina dal tubo.
Solidificare il tappo Agros sul ghiaccio, o a quattro gradi Celsius aggiungere 500 microlitri di PBS nel tubo da 1,5 millilitri per evitare di asciugare il pellet. Acquisire immagini di sezioni sferoidi utilizzando uno stereomicroscopio. Calcolare la quantità di soluzione necessaria per aggiungere 10 microlitri per pozzetto di una miscela di calcio Aam e omodimeri di etidio diluiti usando EBM-2 in un rapporto uno a 50.
Aggiungere la miscela colorante agli sferoidi e posizionare la piastra nell'incubatore sotto lo standard, le condizioni di coltura tissutale per 30-60 minuti. Acquisisci immagini con ingrandimento 40 X utilizzando lo stereomicroscopio a fluorescenza. Nelle placche con fondo a U la formazione di sferoidi è stata osservata 48 ore dopo la semina di sette cellule MCF.
Tuttavia, la formazione di sferoidi non è stata osservata nel caso di cellule endoteliali o cellule linfatiche. La semina di MCF sette più cellule endoteliali o MCF sette più cellule linfatiche in rapporto uno a uno ha anche portato alla formazione di sferoidi. È stata registrata una crescita sequenziale dipendente dal tempo di sette sferoidi MCF che vanno da 24 a 120 ore.
La dimensione degli sferoidi è aumentata da circa 100 micrometri a circa 200 micrometri in cinque giorni. Con un aumento del tasso di crescita osservato negli sferoidi trattati con lo stimolatore della crescita. La struttura degli sferoidi e la forma delle loro cellule non hanno mostrato anomalie a seguito della trasfezione con oligonucleotidi di controllo in presenza di Lipofectamine.
Le cellule che esprimono il loro marcatore proliferativo Ki-67 sono state distribuite in modo omogeneo in questi sferoidi. Cleave to caspase tre colorazioni di questi sferoidi hanno mostrato cellule apatiche dopo quattro giorni di coltura. Lo studio delle cellule in questi sferoidi con CD-31 e Ki-67 ha rivelato che il 55% delle cellule sono epiteliali, il 45% sono endoteliali e il 25% delle cellule proliferano.
Per valutare la percentuale di cellule vive e morte, gli sferoidi di quattro giorni sono stati colorati con calcio Aam ed etidium-omodimer. Uno sferoide appena pensato anche per le cellule morte e vive ha rivelato che gli sferoidi sono molto sensibili alle condizioni di congelamento. Quando si segue il suo protocollo, assicurarsi che le cellule sane vengano utilizzate per mescolare afrodite Un'altra cosa da ricordare sarebbe quella di evitare di danneggiare queste afrodite durante il tappo DP per ottenere una buona sezione anche assicurando al palato l'afrodite prima del across polimerizza.
Questo modello potrebbe essere ulteriormente migliorato includendo altre cellule, come i fibroblasti coinvolti nella progressione del tumore e utilizzandolo per valutare l'efficacia degli agenti terapeutici mirati alla crescita del cancro.
