Questo protocollo ci permette di coltivare microglia in condizioni che imitano da vicino le caratteristiche in vivo. Utilizzando la tecnologia di selezione delle cellule magnetiche, il nostro protocollo ci consente di stimolare la microglia solo due giorni in vitro, senza utilizzare alcun siero nel terreno di coltura. Per iniziare, usa piccole forbici per tagliare la pelle dal collo al naso, seguendo la sutura sagittale da 15 a 20 millimetri.
Inserire le punte con il forame magno parallelo al cranio. Tagliare da ogni lato agli occhi. Tagliare tra gli occhi con piccole forbici per staccare il cranio e il cervello dalla testa.
Con due pinze, afferrare il cranio vicino ai bulbi olfattivi e strappare con cura il cranio. Con una lama di rasoio, rimuovere il cervelletto e il bulbo olfattivo e tagliare il cervello in due pezzi. Posizionare i pezzi di cervello in una capsula di Petri contenente 40 millilitri di HBSS senza calcio e magnesio.
Preparare la miscela di dissociazione secondo questa tabella. Trasferire 12 pezzi di cervello in un tubo C per un peso totale di 1,2 grammi per tubo di dissociazione. Quindi posizionare i tubi C sul dissociatore con riscaldamento.
Avviare il programma NTDK ottimizzato nel dissociatore. Centrifugare per 20 secondi. Completare la dissociazione meccanica mediante pipettaggio tre volte.
Trasferire le celle in quattro tubi da 15 millilitri con filtri collegati. Risciacquare i filtri con 10 millilitri di HBSS con calcio e magnesio. Centrifugare per 10 minuti e rimuovere il surnatante con una pipetta da 10 millilitri.
Aggiungere con cautela 10 millilitri di HBSS con calcio e magnesio e risospendere il pellet. Ancora una volta, centrifugare e rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet con sei millilitri di tampone di selezione.
Ripetere la centrifugazione ed eliminare il surnatante. Quindi aggiungere 200 microlitri di soluzione di microsfere CD11b e incubare i tubi per 15-20 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, risospendere il pellet con sei millilitri di tampone di selezione.
Ripetere la centrifugazione e risospendere il pellet con otto millilitri di tampone di selezione. Quindi, seguire il programma Possel sul separatore per preparare otto colonne. Passare le celle attraverso la colonna aggiungendo un millilitro di sospensione cellulare alla volta.
Con un millilitro di tampone di selezione, eluire le cellule CD11b-positive su una piastra di eluizione sterile. Raggruppa le celle in un tubo da 50 millilitri. Centrifugare e risospendere il pellet con 10 millilitri di mezzo microglia freddo.
Contare le cellule CD11b-positive. Ri-sospendere le cellule nel mezzo microglia freddo per ottenere una concentrazione finale da 650.000 a 700.000 cellule per millilitro. Erogare la sospensione in piastre di coltura cellulare.
Incubare le piastre durante la notte a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, sostituire il mezzo con un mezzo microglia preriscaldato e ripetere l'incubazione notturna. Stimolare le cellule prima di questa fase ed eseguire il test fagocitario durante le ultime tre ore della stimolazione.
Calcola il numero di perline secondo questa tabella con un rapporto di 50 perle per cella. Preparare la miscela di perline. Incubare il tubo per un'ora a bagnomaria a 37 gradi Celsius.
Vortice ogni 10 minuti. A ciascun pozzetto, aggiungere il volume calcolato della soluzione di perline e incubare per tre ore. Utilizzando questo approccio, l'attività fagocitaria della microglia è stata valutata dopo la stimolazione da fattori pro-infiammatori, come l'interleuchina-1 beta, più interferone gamma o lipopolisaccaridi.
Dopo la stimolazione da sei a 24 ore, le sfere fluorescenti della microglia Cy3 sono state analizzate al microscopio confocale. Dopo sei ore, la microglia inizia a falciare le perle Cy3 solo in condizioni di interleuchina-1 beta più interferone gamma. Dopo 24 ore, c'è stato un aumento della fluorescenza Cy3 per entrambi i tipi di stimolazione, evidenziando un aumento dell'attività fagocitaria.
La purezza della coltura microgliale è stata elevata dalla citometria a flusso, che ha mostrato un aumento della vitalità cellulare dopo la selezione. Utilizzando la citometria a flusso e i marcatori di popolazione cellulare RT-qPCR sono stati analizzati prima e dopo aver selezionato cellule CD11b-positive dal cervello dei topi all'ottavo giorno postnatale. Queste analisi hanno distinto varie popolazioni di cellule cerebrali, come CX3CR135 per microglia, O4 o OLIG2 per oligodendrociti, NeuN o sinaptofisina, per i neuroni e ACSA-2 o GFAP per astrociti.
Dopo la selezione cellulare con l'anticorpo CD11b, sono state ottenute solo microglia. È importante pipettare molto delicatamente mentre si aggiunge la sospensione alla colonna per evitare l'intasamento ed evitare la morte meccanica delle cellule. Dopo questo metodo, la proteomica trascrittomica, come il sangue occidentale, o Luminex, e persino l'immunochimica possono essere eseguite per vedere l'effetto della stimolazione microgliale.
