Questo protocollo consente di osservare e rilevare eventi di trascrizione e fornisce informazioni sugli effetti delle rotture a doppio filamento del DNA sulla trascrizione in corso di un gene. Il principale vantaggio della tecnica è l'osservazione di trascritti di RNA marcati individualmente in singole cellule a intervalli di tempo di secondi per un periodo totale di un'ora o più. Questo metodo fornisce informazioni sulla risposta al danno al DNA per indagare la diafonia tra trascrizione e processi cellulari, come la replicazione del DNA e le lesioni del DNA.
Il nostro consiglio è quello di osservare le cellule usando doxiciclina e di eseguire misurazioni di calibrazione per addestrare il rilevamento del sito di trascrizione e delle molecole di RNA etichettate. In un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri, preparare la soluzione A contenente 150 microlitri di DNA plasmatico MEM sierico ridotto e 2,5 microgrammi per microlitro di DNA nel reagente helper di trasfezione. In parallelo, preparare la soluzione B contenente 150 microlitri di MEM sierica ridotta e 1,5 microgrammi per microlitro di DNA in un reagente di trasfezione a base lipidica.
Incubare entrambe le soluzioni a temperatura ambiente per cinque minuti, quindi aggiungere delicatamente la soluzione A alla soluzione B e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Per trasfettare le cellule, aggiungere 300 microlitri di soluzione mista A e B a goccia a ciascun piatto e distribuirlo delicatamente. Conservare il piatto di fondo di vetro all'interno di un piatto di coltura cellulare standard da 100 millimetri e incubarlo a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata con il 5% di anidride carbonica.
Preparare un tubo di microcentrifuga da 1,5 millilitri con 200 microlitri di DMEM con HEPES senza rosso fenolo e integrato con siero bovino fetale spogliato al 10% di carbone, quindi aggiungere TA. Circa un'ora prima di iniziare l'osservazione al microscopio, indurre la trascrizione dei geni reporter aggiungendo doxiciclina al mezzo di crescita e mescolare delicatamente pipettando su e giù con una micropipetta da 200 microlitri. Trasportare le cellule al microscopio almeno 30 minuti prima di iniziare l'osservazione e posizionare il piatto da 100 millimetri con le cellule all'interno della camera di incubazione del microscopio di grandi dimensioni preriscaldata. Posizionare il tubo microcentrifuga con il TA pre-diluito all'interno della grande camera ambientale del microscopio per riscaldarlo a 37 gradi Celsius.
Sostituire il coperchio del piatto inferiore in vetro con un coperchio con un foro foro di tre millimetri di diametro. Selezionare l'obiettivo di immersione in olio 100X nel pannello di controllo del microscopio e applicare una goccia di olio per immersione all'obiettivo. Posizionare il piatto di fondo di vetro con le cellule all'interno della camera di incubazione dello stadio del microscopio e bloccarlo in posizione, quindi chiudere il coperchio dell'incubatore del palco e tutte le porte dell'alloggiamento del microscopio.
Avviare il software di funzionamento e controllo del microscopio, aprire la finestra di controllo della messa a fuoco e fare clic sul riquadro dell'oscilloscopio. Nel riquadro di selezione delle emissioni, fare clic sulla casella 100% per impostare il percorso del fascio oculare per l'osservazione diretta del campione a occhio. Nel menu del set di filtri, passare a impostazione del filtro oculare e fare clic su Brightfield, quindi premere il pulsante Apri Brightfield.
Spostare l'obiettivo del microscopio verso il piatto di fondo di vetro fino a quando l'olio tocca il vetro. Guarda attraverso gli oculari e concentrati manualmente sul piano delle cellule, quindi spegni il pulsante Brightfield aperto. Lasciare le cellule per 30 minuti prima di iniziare le osservazioni sperimentali per consentire loro di adattarsi alle condizioni ambientali e prevenire la deriva focale durante l'imaging a causa di gradienti di temperatura.
Impostare una micropipetta da 200 microlitri e 200 punte per filtri a microlitri a temperatura ambiente. Nella finestra di controllo della messa a fuoco del software di controllo del microscopio, impostare l'intensità del laser su 5% e immettere un valore di 50 millisecondi per il tempo di esposizione. Aprire la finestra di acquisizione per regolare le impostazioni per eseguire un'acquisizione automatica delle immagini dei timelapse tridimensionali.
Selezionare il tipo di acquisizione di acquisizione 3D e impostare da 12 a 16 fette ottiche separate da 0,4 micrometri. Spuntare le caselle di controllo dell'intervallo intorno alla corrente e tornare alla posizione corrente dopo l'acquisizione. Nel riquadro di acquisizione timelapse immettere il valore 120 per il numero di punti temporali e 30 secondi per l'intervallo.
Selezionare il set di filtri confocali in base alle etichette delle proteine fluorescenti transettate come menzionato nel manoscritto di testo e impostare il tempo di esposizione per ciascun canale su 50 millisecondi. Utilizzare la corrente di impostazione per la potenza del laser per utilizzare il valore del 5% selezionato nella finestra di messa a fuoco. Nella finestra di controllo della messa a fuoco, vai al riquadro della fotocamera, seleziona il controllo di visualizzazione dell'immagine in scala e scegli il pulsante manuale per impostare un intervallo fisso di intensità dell'immagine da visualizzare.
Selezionare le cellule per l'imaging timelapse 3D dei siti di trascrizione dopo l'induzione di una rottura del doppio filamento di DNA. Esaminare le celle e selezionare tre campi visivi in base alle condizioni descritte nella discussione del testo. Focalizzare ogni cella selezionata precedentemente situata al centro del campo visivo con il sito di trascrizione nel piano intermedio dello stack Z.
Contrassegnare ogni posizione XYZ nel piano XY della finestra di controllo della messa a fuoco facendo clic su set point. Aggiungi 200 microlitri del TA pre-diluito alle celle e avvia l'imaging della serie temporale 3D facendo clic su avvia nella finestra di acquisizione. Salvare i dati di imaging nel formato di dati del software di controllo del microscopio sul disco rigido del computer di controllo del microscopio.
Aggiungere 0,5 microgrammi per millilitro di doxiciclina al mezzo di crescita delle cellule un'ora prima di iniziare l'acquisizione di immagini al microscopio. Montare la parabola di fondo di vetro all'interno della camera di incubazione dello stadio del microscopio e preparare l'acquisizione dell'immagine come dimostrato in precedenza. Utilizzare le stesse impostazioni di intensità ed esposizione laser di prima.
Impostare le impostazioni di acquisizione per le serie temporali 2D e impostare 120 punti temporali a intervalli di 500 millisecondi nel pannello di acquisizione timelapse. Acquisisci dozzine di serie temporali di calibrazione da più posizioni per generare set di dati per contare diverse centinaia di misurazioni TFI a trascrizione singola. Utilizzando questo protocollo, si ottiene un grafico che mostra il numero di trascrizioni di geni reporter marcati fluorescentemente nel tempo con una risoluzione temporale di secondi su periodi fino a ore.
Il decorso temporale dei valori TFI di un sito di trascrizione genica reporter PROM etichettato dall'accumulo di proteina del mantello MS2 etichettata con le molecole proteiche fluorescenti verdi sui trascritti nascenti è mostrato qui. L'induzione di un singolo DSB nei geni reporter consente di studiarne l'impatto sulla trascrizione genica reporter in corso e sul monitoraggio degli eventi di trascrizione emergenti dal sito DSB, ovvero la trascrizione indotta da rotture. L'aggiunta e l'induzione di TA di un DSB porta ad una soppressione della trascrizione del gene reporter PROM dopo circa 11 minuti che non viene ripristinata fino a 60 minuti.
Il recupero completo del segnale PP7-RFP mostra l'inizio della trascrizione indotta da interruzioni. Il gene reporter antisenso EXON 2 mostra la terminazione delle trascrizioni guidata dal promotore, che viene poi sostituita dalla trascrizione indotta da rottura antisenso come rivelato dall'accumulo di proteina del mantello MS2 etichettata con una proteina fluorescente rossa che si lega all'RNA generata da sequenze di loop staminali MS2 antisenso. Selezione delle cellule per l'imaging, impostare l'imaging timelapse trattato regolando la posizione Z del sito di trascrizione etichettato su ciascuna posizione XY nel centro dello stack Z da acquisire.
E infine, l'aggiunta del TA diluito nel mezzo di crescita deve essere eseguita con estrema cura per evitare eventuali spostamenti delle posizioni preselezionate con cellule da visualizzare. L'imaging di singoli trascritti di RNA in 3D nel tempo in cellule vive può essere applicato per studiare la trascrizione dell'RNA durante la replicazione del DNA o i cambiamenti di trascrizione durante la progressione del ciclo cellulare.
