CM riconosce il sostegno finanziario dell&#39;Organizzazione Internazionale del Paziente per le Deficienze C1-Inibitore (HAEi), Stichting Vrienden van Het UMC Utrecht e la Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR).

Il Comitato Etico Medico Comunale del Centro Medico Universitario di Utrecht ha approvato il disegno del sangue per scopi di ricerca ex vivo , inclusi quelli di questo studio. 1. Preparazione della soluzione <ol><li> Preparare un buffer di Tyrode di 4- (2-idrossietil) -1-piperazinattanesolfonico sciogliendo 10 mM HEPES, 0,5 mM Na 2 HPO 4 , 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO4 e 5,55 mM D- Glucosio in acqua distillata. <ol><li> Fare due varianti del buffer: impostare i livelli di pH a 6,5 ​​e rispettivamente a 7,4. Fai buca fresca per ogni giorno di esperimenti. Supplemento con 10 ng / ml prostacyclin dove indicato. </li></ol></li><li> Preparare la soluzione salina tricolata TRIS (TBS) dissolvendo 50 mM Tris e 150 mM NaCl in acqua distillata e regolare il pH a 9.0. </li><li> Preparare il destrosio acido citrato (ACD) sciogliendo 85 mM tri-sodio citrato, 71 mM acido citrico e 111 mM D-glucosio in disAcqua stagionata. </li><li> Preparare una soluzione fissativa aggiungendo la paraformaldeide (PFA) del 2% (v / v) al tampone di HEPES Tyrode, pH 7,4. Scaldare per dissolvere (50 - 70 ° C) e impostare il pH a 7,4. Aliquota e conservare a -20 ° C. Scongelare a 37 ° C prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare il tampone di bloccaggio sciogliendo l&#39;albumina umana (HSA) dell&#39;1% (m / v) nel tampone di HEPES Tyrode, pH 7,4 </li><li> Creare una soluzione di alcool polivinilico aggiungendo 4,8 g di alcool polivinilico a 12 g di glicerolo e mescolare bene. Aggiungere 12 ml di acqua distillata e lasciarlo su rotatore a temperatura ambiente durante la notte. <ol><li> Aggiungere 24 ml di 0,2 M Tris-HCL, pH 8,5. Riscaldare a 50 ° C mentre si mescola per 30 min. Aggiungere 1,25 g di 1,4-diazabiciclo [2.2.2] ottano (DABCO) e mescolare bene. Centrifugare a 1.500 xg per 5 min. Aliquota il surnatante (1 mL è sufficiente per 15-20 diapositive) e conservare a -20 ° C. Usate le aliquote una volta. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione del vetro di copertura <ol><li> Sgrassare la coperturaBicchieri (25 x 50 mm 2 ) incubando durante la notte in acido cromosumpurico non diluito. Sciacquare gli occhiali con acqua distillata e asciugarli per una notte a 60 ° C in un forno. </li><li> Aderire una striscia di una pellicola paraffina (10 x 15 cm 2 ) in cima a una panca da laboratorio con una goccia d&#39;acqua e rimuovere l&#39;aria lisciando la pellicola paraffina. Pipettare 80 μL gocce di 10 μg / mL VWF o 100 μg / mL fibrinogeno sulla pellicola paraffina. Posizionare gli occhiali sulle gocce; La soluzione proteica si diffonde tra le due superfici per coprire l&#39;intera parte posteriore del vetro. Incubare per 1,5 ore a temperatura ambiente (RT). </li><li> Rimuovere la pellicola paraffina e bloccare i vetri di copertura posizionandoli, con il lato rivestito in su in una piastra a 4 pozzetti con blocco di blocco. Incubare per 1 ora a 37 ° C o per una notte a 4 ° C. Come controllo, bloccare un vetro di copertura non rivestito con VWF o fibrinogeno. </li></ol> 3. Preparazione del plasma ricco di piastrine (PRP) </p&gt; <ol><li> Raccogliere il sangue intero citrato (concentrazione finale: 0,32% citrato di sodio (M / V)) mediante venipunzione. </li><li> Centrifugare il sangue per 15 minuti a 160 xg e RT senza freno. Raccogliere il surnatante ( ossia il PRP) con una pipetta in plastica Pasteur. NOTA: Dopo la centrifugazione si possono osservare tre strati (dall&#39;alto verso il basso): PRP, globuli bianchi e globuli rossi. Assicurarsi di non includere le celle bianche e rosse. Tipicamente, 3 ml di PRP possono essere raccolti dopo la centrifugazione di un tubo di sangue da 9 ml. </li><li> Continuare alla sezione 4 se l&#39;esperimento verrà eseguito con le piastrine lavate. Se si desidera utilizzare PRP, continuare con il passaggio successivo. </li><li> Dopo la raccolta PRP, centrifugare nuovamente il resto del sangue (contenente il pellet di cellule rosse) di nuovo per 10 minuti a 2.000 xg senza freno. Raccogliere il surnatante contenente il plasma poverico delle piastrine (PPP). NOTA: In genere, 2 mL possono essere raccolti dopo questa seconda fase di centrifugazione. </li><li> Conte il numero del pLatte nel PRP su un analizzatore di celle e diluirlo con il PPP (fase 3.4) ad una concentrazione di 150.000 piastrine / μL. NOTA: Il volume totale di PRP diluito dipende dal numero di piastrine del donatore. I conteggi delle piastrine variano notevolmente tra i donatori e la diluizione di PRP richiede una valutazione su base individuale. Le conta piastrine sono considerate normali quando si trovano entro 150.000 e 450.000 piastrine / μL. </li><li> Continuare alla sezione 5. </li></ol> 4. Preparazione di piastrine lavate <ol><li> Determinare il volume medio delle piastrine (MPV) nel PRP utilizzando un analizzatore di celle. NOTA: Questo è un indicatore della pre-attivazione delle piastrine 11 . Un MPV normale per le piastrine di riposo è di 7,5-11,5 fL 11 . Il MPV non dovrebbe aumentare di più di 1,5 fL durante la procedura di lavaggio delle piastrine. </li><li> Aggiungere un volume 1/10 di ACD a PRP per prevenire la pre-attivazione delle piastrine e centrifugare per 15 minuti a 400 xg e RT senza freno. Rimuovere la suPernatante e ri-sospendere attentamente il pellet nel tampone di HEPES Tyrode, pH 6,5, al volume originale di PRP. </li><li> Sciogliere una aliquota di prostacyclin aggiungendo TBS ad una concentrazione di 10 μg / mL; Tenerlo su ghiaccio. </li><li> Per prevenire l&#39;attivazione delle piastrine, aggiungere prostaciclina a una concentrazione finale di 10 ng / mL alle piastrine ri-sospese e centrifugare immediatamente per 15 minuti a 400 xg e RT senza freni. Rimuovere il surnatante e ri-sospendere attentamente il pellet nel tampone di HEPES Tyrode, pH 7.4. </li><li> Conta il numero delle piastrine (passo 3.5) e determinare la variazione nella MPV (passo 4.1) (il MPV non deve cambiare più di 1,5 fL). </li><li> Regolare il numero di piastrine con il tampone di HEPES Tyrode, pH 7.4, ad una concentrazione di 150.000 piastrine / μL. Lasciare le piastrine per recuperare per 30 minuti a RT prima degli esperimenti. Usare le piastrine lavate per esperimenti entro 4 ore dall&#39;isolamento. </li></ol> 5. Assemblea della camera di flusso 12 . Possono essere utilizzate varie camere di flusso commercialmente prodotte, purché possano contenere un vetro di copertura, preferibilmente rimovibile per ulteriori analisi. La camera di flusso utilizzata per le esperienze descritte è costituita da poli (metilacrilato) per adattarsi in modo preciso allo stadio di inserimento del microscopio. Contiene un ingresso e uscita ( Figura 1A - C ; 1, 2), nonché una connessione a vuoto ( Figura 1A e C ; 3). Una lastra di silicone personalizzata ( Figura 1A e D ; 4) è posta sulla parte superiore. Due estremità formano i canali di vuoto ( Figura 1A e D ; 5) per fissare strettamente la camera di copertura ( Figura 1A ; 6) alla camera. Un taglio centrale forma il canale di flusso ( Figura 1A </strong&gt; E D ; 7; 2,0 mm di larghezza e 0,125 mm di altezza). L&#39;ingresso e la presa sono collegati al canale di flusso e il vuoto è collegato al canale di vuoto. <ol><li> Coprire la parte superiore della camera di flusso con acqua distillata e posizionare il foglio in silicone personalizzato con il lato liscio in basso sull&#39;acqua. Spostare il foglio in posizione rimuovendo l&#39;acqua in eccesso pur mantenendo il foglio in posizione. NOTA: questo foglio di silicone è riutilizzabile (il silicone è noto per le sue proprietà inerte); In genere, le piastrine non sono state osservate per aderire a essa. Le lenzuola possono essere pulite con detersivo e riutilizzate fino a quando il materiale non viene danneggiato ( cioè strappo, soprattutto nella zona tra i canali). In genere, un foglio può essere utilizzato per 20 giorni con più esperimenti al giorno. </li><li> Incubare la camera di flusso per 1 h a 60 ° C per evaporare l&#39;acqua residua per fissare saldamente il foglio di silicone alla camera di flusso. </li><li> Con una pipetta di Pasteur plastica, aggiungere una goccia diTampone di HEPES Tyrode, pH 7.4, sul canale di flusso. Posizionare il vetro di copertura (vedi sezione 2) con il lato rivestito rivolto verso il basso, sul canale di flusso. Collegare la pompa a vuoto alla connessione a vuoto ( figure 1A e C ; 3). Applicare pressione ~ 10 kPa. </li></ol> 6. Pre-colorazione delle piastrine e preparazione degli anticorpi <ol><li> Colorazione delle piastrine <ol><li> Incubare le piastrine lavate con 10 μg / mL DAPI per 30 minuti a 37 ° C al buio. Per lavare via DAPI non legato e per prevenire l&#39;attivazione delle piastrine, aggiungere prostacyclin ad una concentrazione finale di 10 ng / mL e immediatamente centrifugare per 15 minuti a 400 xg e RT senza freno. </li><li> Ricostituire il pellet piastrinico nel tampone di HEPES Tyrode, pH 7.4, ad una concentrazione di piastrine di 150.000 piastrine / μL. </li></ol></li><li> Preparazione degli anticorpi <ol><li> Mescolare l&#39;anticorpo biotino-etichettato con strep etichettato con AlexaTavidin a un rapporto molare di 1: 1. Incubare per almeno 10 minuti a temperatura ambiente prima dell&#39;uso (passo 7.6). NOTA: L&#39;efficienza di etichettatura della biotina può variare tra i diversi lotti. In caso di problemi con la visualizzazione delle molecole bersaglio occorre eseguire esperimenti di controllo per confermare la biotinilazione riuscita, nonché le proprietà vincolanti dell&#39;obiettivo specifico dell&#39;anticorpo biotinilato. </li></ol></li></ol> 7. Perfusione <ol><li> Avviare il microscopio a fluorescenza, oltre al microscopio. Utilizzare le impostazioni del microscopio elencate nella tabella 1 . NOTA: Inizia la microscopia e le impostazioni di registrazione per la visualizzazione e la registrazione delle cellule vive delle piastrine e degli anticorpi e / o coloranti contrassegnati fluorescenti caricando un esperimento appropriato nel software del microscopio. Eseguire esperimenti di flusso a RT. </li><li> Bloccare il tubo di entrata collegando una siringa da 10 ml alla tubazione e aspirando 1% HSA bloTamponare il tampone nel tubo di entrata. Incubare per 15 minuti a RT. Sciacquare il tubo di ingresso aspirando il tampone di HEPES Tyrode, pH 7.4, nel tubo di ingresso. </li><li> Collegare il tubo di ingresso bloccato e il tubo di scarico non trattato, entrambi con un diametro di 1,02 mm e una lunghezza di circa 20-30 cm, all&#39;entrata e all&#39;uscita della camera. Collegare una siringa da 10 ml (o un volume più basso per maggiore precisione) al tubo di uscita. Accendere la pompa della siringa. NOTA: Il diametro della siringa, in combinazione con la portata impostata sulla pompa, determina la portata volumetrica. Insieme alla superficie del canale di flusso, la velocità di taglio può essere calcolata in base alla formula 13 sotto. Di conseguenza, è possibile manipolare la velocità di taglio cambiando la portata della pompa della siringa o alterando le dimensioni del canale di flusso. Una velocità di taglio di 800-1.600 s -1 tipicamente modelli per il flusso sanguigno arterioso, mentre 25-100 s-1 modelli per il sangue venosoflusso. Per questa impostazione, una portata di 7,5 μL / min determina una velocità di taglio di 25 s -1 . Velocità di taglio = 6Q / h 2 w in s -1 Dove: Q = portata volumetrica (mL / s), h = canale di altezza (cm) (0.0125 cm; spessore del foglio di silicone); w = canale di larghezza (cm) (0,2 cm in questa camera). </li><li> Posizionare una goccia di olio di immersione su un obiettivo 100X (amplificazione totale di 1.000x) e montare la camera sul microscopio con la superficie in vetro verso il basso. </li><li> Posizionare il tubo di ingresso in un tubo contenente il tampone HEPES Tyrode, pH 7.4. Tirare manualmente lo stantuffo della siringa collegato al tubo di uscita e tirare la soluzione attraverso la camera per rimuovere l&#39;aria dal sistema. Posizionare la siringa nella pompa della siringa ( Figura 1B e C ; 8) ed eseguire brevemente la pompa per stringere lo stantuffo e assicurare un flusso stabile. </li><li> Aggiungere gli anticorpi e / oi coloranti alla sospensione piastrinica o alla PRP, con attenzioneMescolare con una pipetta di plastica e trasferire la miscela in un tubo da 1,5 ml. NOTA: Per una perfusione tipica di 30 min alla velocità di taglio 25 s-1 (7,5 μL / min), è necessario un minimo di 225 μL di sospensione piastrinica. Gli anticorpi utilizzati per i risultati rappresentativi sono mostrati nella Tabella 2 . </li><li> Spostare il tubo di entrata, pur spremendolo, dal tampone di TRODE di Hepes, pH 7,4, in un tubo da 1,5 mL contenente PRP o le piastrine lavate e gli anticorpi e / o coloranti ( Figura 1B e C ; 9). NOTA: È importante che durante il trasferimento del tubo la tubazione sia compressa (premendo l&#39;aria) per impedire l&#39;ingresso dell&#39;aria nel tubo. È possibile trattare le piastrine aderenti con una varietà di reagenti in un passaggio successivo spostando il tubo di entrata in un altro tubo in modo simile. Un elenco di reagenti potenzialmente utili è fornito nella tabella 3 . </li><li> Selezionare la &quot;visualizzazione in diretta&quot;N &quot;nel software, mettere a fuoco il microscopio sulla superficie del vetro rivestito rivestito e avviare la pompa a una velocità di taglio di 1.600 s-1 (484 μL / min) fino a quando le piastrine raggiungono la camera di flusso.In questo momento, Ridurre la velocità di taglio a 25 s-1 modificando le impostazioni della pompa della siringa ad una portata di 7,5 μL / min. </li><li> Monitorare la superficie del lato rivestito del vetro di copertura, attendere che la prima piastrina inizia ad aderire, mettere a fuoco il microscopio su questa piastrina e avviare la registrazione avviando l&#39;esperimento nel software. Vedere la Tabella 1 per le impostazioni di registrazione utilizzate qui. </li><li> Seguire visivamente la registrazione dal vivo. Dopo 30 minuti, arrestare la pompa della siringa. NOTA: Assicurarsi che le piastrine rimangano a fuoco durante il corso dell&#39;esperimento. In genere, 20-30 piastrine si collegano nel campo visivo ad un ingrandimento di 1.000X; Si tratta di circa 2.000-3.000 piastrine in tutto il canale di flusso. </li><li> Fissazione usandoLa camera di flusso (opzionale). <ol><li> Quando il flusso si è arrestato dopo che la pompa della siringa è ferma, trasferire il tubo di entrata (senza aria) alla soluzione fissativa. Riavviare la pompa e passare il buffer di fissaggio attraverso il canale per un minimo di 10 minuti alla stessa portata di cui al punto 7.8. </li></ol></li><li> Rimuovere la camera dal microscopio, pulire l&#39;olio da immersione dal vetro, scollegare il vuoto e rimuovere con cura l&#39;involucro dalla camera con un ago da 18 G. NOTA: impedire che il vetro di copertura rompe e che danneggia il foglio di silicio. </li><li> Posizionare lo scivolo del coperchio (con le celle dirette verso l&#39;alto) in una piastra a 4 pozzetti in cima a un tessuto pre-imbevuto di acqua distillata. NOTA: questo impedisce che il vetro di copertura si adesca alla superficie del pozzetto e impedisca l&#39;essiccazione. </li><li> Pipettare 750 μL di soluzione fissativa sulla parte superiore del vetro di copertura e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Nel caso in cui i campioni non possano essere analizzati direttamente,Conservarli in 0,5% PFA (diluito con il tampone di HEPES Tyrode, pH 7,4) a 4 ° C per garantire una fissazione stabile. Procedere alla sezione 8 per elaborare il vetro di copertura per la fotografia. </li><li> Dopo l&#39;uso, sciacquare la camera, il tubo e il foglio con acqua distillata e incubare per una notte in una soluzione detergente. Prima del riutilizzo della camera e di altri componenti, risciacquare con acqua distillata. </li><li> Salvare i file di dati raw del microscopio contenenti tutti i metadati. Se necessario, esportare i filmati su .MOV, h.264 compressi o. AVI non compressi. Salvare i fotogrammi separati come file JPEG o TIF. </li></ol> 8. Preparazione del campione per la microscopia a fluorescenza confocale <ol><li> Trasferire i vetri di copertura a nuovi piatti a 4 pozzetti e sciacquare 5 volte con 3 ml di tampone HEPES Tyrode, pH 7,4. Aggiungere 3 mL / pozzetto di tampone di blocco e incubare per 1 ora a RT. </li><li> Rimuovere il buffer di blocco; Aggiungere 3 ml / pozzetto di glicina 0,15% (M / V) nel tampone di HEPES Tyrode, pH 7,4; E incubare per 15 minuti a RT. </li><li> Rimuovere la soluzione di glicina e lavare 5 volte in 3 mL / pozzetto di tampone di blocco. Facoltativamente, aggiungere anticorpi coniugati con fluoroforo diluiti nel buffer di blocco per ulteriori colorazioni. Incubare per 1 h a RT al buio. </li><li> Lavare 5 volte con tampone di blocco e 2 volte con acqua distillata. Asciugare il vetro rimuovendo il liquido in eccesso con un tessuto (dai bordi verso l&#39;interno), senza toccare le celle. </li><li> Pipettare 60 μL di soluzione di alcool polivinilico su uno scivolo a microscopio. Posizionare il vetro di copertura, con le cellule in basso, in cima alla goccia e lasciare che l&#39;alcool polivinilico si diffonda tra le due superfici. Incubare durante la notte in RT all&#39;oscurità. </li><li> Analizzare le cellule mediante la microscopia confocale 14 . </li><li> Salvare i file di dati raw dei dati registrati dello stack contenenti tutti i metadati. Quando necessario, elaborare i file di dati grezzi nei file compressi MOV, h.264 compressi o .AVI. Salvare gli stack separati come file JPEG o TIF. </li></ol>

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	<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=von+Willebrand+factor,+Jedi+knight+of+the+bloodstream.">von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream.</a> Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).</li><li>Fitch-Tewfik, J. L., Flaumenhaft, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+granule+exocytosis:+a+comparison+with+chromaffin+cells.">Platelet granule exocytosis: a comparison with chromaffin cells.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 4, 11 (2013).</li><li>May, B., Menkens, I., Westermann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+release+of+serotonin+and+histamine+from+blood+platelets+of+the+rabbit+by+aliphatic+and+aromatic+amines.">Differential release of serotonin and histamine from blood platelets of the rabbit by aliphatic and aromatic amines.</a> Life Sci. 6 (19), 2079-2085 (1967).</li><li>Schmaier, A. H., Smith, P. M., Colman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+C1-+inhibitor.+A+secreted+alpha-granule+protein.">Platelet C1- inhibitor. A secreted alpha-granule protein.</a> J. Clin. Invest. 75 (1), 242-250 (1985).</li><li>Battinelli, E. M., Markens, B. A., Italiano, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+angiogenesis+regulatory+proteins+from+platelet+alpha+granules:+modulation+of+physiologic+and+pathologic+angiogenesis.">Release of angiogenesis regulatory proteins from platelet alpha granules: modulation of physiologic and pathologic angiogenesis.</a> Blood. 118 (5), 1359-1369 (2011).</li><li>Kamykowski, J., Carlton, P., Sehgal, S., Storrie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+immunofluorescence+mapping+reveals+little+functional+coclustering+of+proteins+within+platelet+&#945;-granules.">Quantitative immunofluorescence mapping reveals little functional coclustering of proteins within platelet &#945;-granules.</a> Blood. 118 (5), 1370-1373 (2011).</li><li>Sakariassen, K. S., Aarts, P. A., de Groot, P. G., Houdijk, W. P., Sixma, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perfusion+chamber+developed+to+investigate+platelet+interaction+in+flowing+blood+with+human+vessel+wall+cells,+their+extracellular+matrix,+and+purified+components.">A perfusion chamber developed to investigate platelet interaction in flowing blood with human vessel wall cells, their extracellular matrix, and purified components.</a> J Lab Clin Med. 102 (4), 522-535 (1983).</li><li>Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Flow+Chambers+Using+Reconstituted+Blood+to+Model+Hemostasis+and+Platelet+Transfusion+In+Vitro.">Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li><li>Nesbitt, W. S., Westein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+shear+gradient-dependent+platelet+aggregation+mechanism+drives+thrombus+formation.">A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation.</a> Nat Med. 15 (6), 665-673 (2009).</li><li>Mitchell, J. L., Lionikiene, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphosphate+colocalizes+with+factor+XII+on+platelet-bound+fibrin+and+augments+its+plasminogen+activator+activity.">Polyphosphate colocalizes with factor XII on platelet-bound fibrin and augments its plasminogen activator activity.</a> Blood. 128 (24), 2834-2845 (2016).</li><li>Park, Y., Schoene, N., Harris, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mean+platelet+volume+as+an+indicator+of+platelet+activation:+methodological+issues.">Mean platelet volume as an indicator of platelet activation: methodological issues.</a> Platelets. 13 (5-6), 301-306 (2002).</li><li>Sixma, J. J., de Groot, P. G., van Zanten, H., IJsseldijk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+perfusion+chamber+to+detect+platelet+adhesion+using+a+small+volume+of+blood.">A new perfusion chamber to detect platelet adhesion using a small volume of blood.</a> Thromb Res. 92, S43-S46 (1998).</li><li>Slack, S. M., Turitto, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+chambers+and+their+standardization+for+use+in+studies+of+thrombosis.+On+behalf+of+the+Subcommittee+on+Rheology+of+the+Scientific+and+Standardization+Committee+of+the+ISTH.">Flow chambers and their standardization for use in studies of thrombosis. On behalf of the Subcommittee on Rheology of the Scientific and Standardization Committee of the ISTH.</a> Thromb Haemost. 72 (5), 777-781 (1994).</li><li>Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinning-disk+confocal+microscopy:+present+technology+and+future+trends.">Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends.</a> Methods Cell Biol. 123, 153-175 (2014).</li><li>Nishibori, M., Cham, B., McNicol, A., Shalev, A., Jain, N., Gerrard, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+CD63+is+in+platelet+dense+granules,+is+deficient+in+a+patient+with+Hermansky-Pudlak+syndrome,+and+appears+identical+to+granulophysin.">The protein CD63 is in platelet dense granules, is deficient in a patient with Hermansky-Pudlak syndrome, and appears identical to granulophysin.</a> J. Clin. Invest. 91 (4), 1775-1782 (1993).</li><li>Ruiz, F. A., Lea, C. R., Oldfield, E., Docampo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+dense+granules+contain+polyphosphate+and+are+similar+to+acidocalcisomes+of+bacteria+and+unicellular+eukaryotes.">Human platelet dense granules contain polyphosphate and are similar to acidocalcisomes of bacteria and unicellular eukaryotes.</a> J. Biol. Chem. 279 (43), 44250-44257 (2004).</li><li>Tersteeg, C., Fijnheer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+von+Willebrand+Factor+under+Control:+Alternatives+for+ADAMTS13.">Keeping von Willebrand Factor under Control: Alternatives for ADAMTS13.</a> Semin Thromb Hemost. 42 (1), 9-17 (2016).</li><li>Tersteeg, C., de Maat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmin+cleavage+of+von+Willebrand+factor+as+an+emergency+bypass+for+ADAMTS13+deficiency+in+thrombotic+microangiopathy.">Plasmin cleavage of von Willebrand factor as an emergency bypass for ADAMTS13 deficiency in thrombotic microangiopathy.</a> Circulation. 129 (12), 1320-1331 (2014).</li><li>Basir, A., de Groot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Hemocompatibility+Testing+of+Dyneema+Purity+Fibers+in+Blood+Contact.">In Vitro Hemocompatibility Testing of Dyneema Purity Fibers in Blood Contact.</a> Innovations (Phila). 10 (3), 195-201 (2015).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In tutto il mondo, la trombosi è una causa principale di morte e morbilità e le piastrine hanno un ruolo centrale nel suo sviluppo. Questo lavoro descrive un metodo per l&#39;imaging a cellule vive della degranulazione piastrinica sotto il flusso. Generalmente si presume che, quando le piastrine si attivano, tutti i contenuti granulari vengono direttamente rilasciati in soluzione. I risultati di accompagnamento suggeriscono che questo non è necessariamente il caso. Durante l&#39;aderenza e la degranulazione, le piast...

Le piastrine sono cellule anucleate che circolano nel flusso sanguigno. La loro funzione principale è quella di sigillare le ferite vascolari nei siti di lesioni e di prevenire la perdita di sangue. In questi siti di lesioni, le fibre di collagene subendoteliale diventano esposte e successivamente sono coperte dalla proteina multimerica, il fattore von Willebrand (VWF). VWF interagisce con le piastrine in circolazione in un meccanismo che dipende dal complesso glicoprotein Ibα-IX-V sulla superficie cellulare 1 , rallentando la velocità delle piastrine. Ciò è particolarmente importante a velocità elevate. Le piastrine successivamente subiscono cambiamenti morfologici mentre ricevono impulsi di attivazione dal collagene. Ciò porta ad una diffusione irreversibile e alla fine alla aggregazione piastrinica. Entrambi i processi dipendono dalla secrezione del contenuto di granuli per facilitare la crosstalk piastrinica. Tra gli altri, le piastrine α-granuli contengono fibrinogeno e VWF per assistere l&#39;adesione piastrinica e per ponteLe piastrine insieme in un modo integrin-dipendente. I granuli piastriniti contengono composti inorganici 2 , inclusi il calcio e l&#39;adenosina difosfato (ADP), che contribuiscono a rafforzare l&#39;attivazione delle piastrine. Inoltre, le piastrine contengono mediatori di infiammazione (allergica) 3 , proteine ​​di controllo del complemento 4 e fattori di angiogenesi 5 , 6 , sollevando le questioni di se e come tali contenuti vengono diffusi differenzialmente in condizioni diverse. Dagli anni Ottanta, lo studio della funzionalità piastrinica nei modelli di flusso è stato prezioso per la ricerca di meccanismi trombotici 7 . Da allora, sono stati fatti molti progressi tecnici e sono stati sviluppati modelli di flusso che includono la formazione di fibrina per analizzare il potenziale emostatico dei concentrati terapeutici piastrinici ex vivo 8 oIndagare l&#39;influenza dei disturbi in velocità di taglio sulla morfologia del trombo 9 . Le differenze nei meccanismi molecolari e cellulari che conducono adesione stabile e formazione di trombi fisiologici (emostasi) rispetto alla formazione di trombi patologici (trombosi) possono essere molto sottili e motivare lo sviluppo di modelli di flusso che consentono la visualizzazione in tempo reale di queste subcellulari processi. Un esempio di un processo per cui una tale configurazione sarebbe preziosa è la (ri) distribuzione del polifosfato intracellulare e l&#39;assunzione di fattori di coagulazione per scoprire l&#39;impatto dipendente dal tempo che questo ha sull&#39;ultrastruttura della fibrina 10 . Gli studi sono spesso limitati alle analisi dei punti finali. Lo scopo principale del metodo descritto è quello di consentire l&#39;esame visivo in tempo reale dei processi subcellulari dinamici che si verificano durante l&#39;attivazione piastrinica sotto flusso.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1340">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)&#160;</td>
			<td style="width:295px;">VWR</td>
			<td style="width:227px;">441476L</td>
			<td style="width:372px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:295px;">Sigma</td>
			<td style="width:227px;">S-0876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:295px;">Sigma</td>
			<td style="width:227px;">31434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:295px;">Sigma</td>
			<td style="width:227px;">31248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgSO4</td>
			<td style="width:295px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:227px;">1.05886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose</td>
			<td style="width:295px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:227px;">1.04074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prostacyclin&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Cayman Chemical</td>
			<td style="width:227px;">18220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tri-sodium citrate</td>
			<td style="width:295px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:227px;">1.06448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Citric acid&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:227px;">1.00244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover glasses</td>
			<td style="width:295px;">Menzel-Gl&#228;ser</td>
			<td style="width:227px;">BBAD02400500#A</td>
			<td>24x50mm, No. 1 = 0.13-0.16 mm thickness.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:447px;">Chromosulfuric acid (2% CrO3)</td>
			<td style="width:295px;">Riedel de Haen</td>
			<td>07404</td>
			<td>CAS [65272-70-0].</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Von Willebrand factor (VWF)</td>
			<td style="width:295px;">in-house purified</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fibrinogen</td>
			<td style="width:295px;">Enzyme Research Laboratories</td>
			<td style="width:227px;">FIB3L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4 well dish, non-treated</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:227px;">267061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Serum Albumin Fraction V</td>
			<td style="width:295px;">Haem Technologies Inc.</td>
			<td style="width:227px;">823022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blood collection tubes, 9 ml, 9NC Coagulation Sodium Citrate 3.2%</td>
			<td style="width:295px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:227px;">455322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell analyser&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Abbott Diagnostics</td>
			<td style="width:227px;">CELL-DYN hematology analyzer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:295px;">Sigma</td>
			<td>30525-89-4&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:295px;">Harvard Apparatus, Holliston, MA</td>
			<td style="width:227px;">Harvard apparatus 22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 mL syringe with 14.5 mm diameter</td>
			<td style="width:295px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:227px;">305959</td>
			<td>Luer-Lok syringe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Anti-CD63-biotin&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Abcam&#160;</td>
			<td style="width:227px;">AB134331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Anti-CD62P-biotin&#160;</td>
			<td style="width:295px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:227px;">Dy137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8217;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td style="width:295px;">Polysciences Inc.&#160;</td>
			<td style="width:227px;">9224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>S11223&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immersion oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444963-0000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Detergent solution</td>
			<td>Unilever, Biotex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56-40-6&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyvinyl alcohol</td>
			<td style="width:295px;">Sigma</td>
			<td>9002-89-5</td>
			<td>Mowiol 40-88.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris hydrochloride</td>
			<td style="width:295px;">Sigma</td>
			<td>1185-53-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)</td>
			<td style="width:295px;">Sigma</td>
			<td>280-57-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sheep Anti-hVWF pAb</td>
			<td>Abcam&#160;</td>
			<td style="width:227px;">AB9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Alexa fluor 488-NHS</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:227px;">A20000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:227px;">15523-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Parafinn film</td>
			<td style="width:295px;">Bemis</td>
			<td style="width:227px;">PM-996</td>
			<td>4 in. x 125 ft. Roll.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Silicone sheet non-reinforced</td>
			<td style="width:295px;">Nagor</td>
			<td style="width:227px;">NA 500-1</td>
			<td>200mmx150mmx0.125mm.</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:447px;">Customized cut silicone sheet with perfusion and vacuum channels</td>
			<td style="width:295px;">in-house made</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td>Made of Silicone sheet non-reinforced (Nagor, NA 500-1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">1.5 mL tubes</td>
			<td style="width:295px;">Eppendorf AG</td>
			<td style="width:227px;">T9661-1000AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Fluorescent microscope</td>
			<td style="width:295px;">Zeiss Observer Z1&#160;</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td>Equiped with LED excitation lights.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Microscope software</td>
			<td style="width:295px;">Zeiss ZEN 2</td>
			<td style="width:227px;">blue edition</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">18 G needle (18 G x 1 1/2&#34;)</td>
			<td style="width:295px;">BD biosciences</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">NaCl</td>
			<td style="width:295px;">Riedel de Haen</td>
			<td style="width:227px;">31248375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Tris</td>
			<td style="width:295px;">Roche</td>
			<td style="width:227px;">10708976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Plastic pasteur pipet</td>
			<td style="width:295px;">VWR</td>
			<td style="width:227px;">612-1681</td>
			<td>&#160;7 ml non sterile, graduated up to 3ml.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Silicone tubing</td>
			<td style="width:295px;">VWR</td>
			<td style="width:227px;">228-0656</td>
			<td>Inner diamete. x Outer diameter x Wall thickness = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:227px;">ABAA000001##12E</td>
			<td>76 x 26 x 1 mm, ground edges 45&#176;, frosted end.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-cell imaging of platelet degranulation and secretion under flow

Le piastrine di sangue sono giocatori essenziali in emostasi, la formazione di trombi per sigillare violazioni vascolari. Sono anche coinvolti nella trombosi, nella formazione di trombi che occludono la vascolarizzazione e danno gli organi, con conseguenze pericolose per la vita. Questo motiva la ricerca scientifica sulla funzionalità piastrinica e lo sviluppo di metodi per tenere traccia dei processi biologici in fase di flusso. Sono disponibili diversi modelli di flusso per lo studio dell&#39;adesione e dell&#39;aggregazione delle piastrine, due fenomeni chiave della biologia piastrinica. Questo lavoro descrive un metodo per studiare la degranulazione piastrinica in tempo reale in fase di attivazione. Il metodo utilizza una camera di flusso accoppiata ad una messa a punto della pompa a siringa posta sotto un microscopio a fluorescenza a LED basato su ampio campo, invertito. L&#39;impostazione qui descritta consente l&#39;eccitazione simultanea di fluorofori multipli che vengono fornite da anticorpi a fluorescenza o fluorescentiColoranti ent. Dopo gli esperimenti di immagini a cellule vive, i vetri di copertura possono essere ulteriormente elaborati e analizzati utilizzando microscopia statica ( cioè microscopia confocale o microscopia a scansione elettronica).

La figura 1 mostra le immagini della camera di flusso e della configurazione sperimentale; La posizione e le dimensioni del foglio di silicio; E connessioni tubi. La Figura 2 fornisce i dettagli sulle dimensioni della camera di flusso. La figura 3 e il filmato 1 mostrano una serie di immagini di adesione e diffusione piastrinica su VWF immobilizzato. CD63 è una proteina transmembra...

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Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Questo lavoro descrive un metodo basato sulla microscopia a fluorescenza per lo studio dell&#39;adesione piastrinica, della diffusione e della secrezione sotto flusso. Questa piattaforma versatile permette di studiare la funzione piastrinica per la ricerca meccanicistica sulla trombosi e sull&#39;emostasi.

Imaging di cellule vive di degranulazione piastrinica e secrezione sotto flusso

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

live-cell-imaging-of-platelet-degranulation-and-secretion-under-flow

Research

JoVE Journal

Biology

11.5K Views.  University Medical Center Utrecht.  Questo lavoro descrive un metodo basato sulla microscopia a fluorescenza per lo studio dell'adesione piastrinica, della diffusione e della secrezione sotto flusso. Questa piattaforma versatile permette di studiare la funzione piastrinica per la ricerca meccanicistica sulla trombosi e sull'emostasi. 

Video: Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique advantage of FSM is its ability to capture the movement and turnover kinetics (assembly/disassembly) of the F-actin network within living cells. This technique is particularly useful in deriving quantitative measurements of F-actin dynamics when paired with computer vision software (qFSM).  We describe  the selection, microinjection and visualization of fluorescent actin probes in living cells. Importantly, similar procedures are applicable to visualizing other macomolecular assemblies. FSM has been demonstrated for microtubules, intermediate filaments, and adhesion complexes.  

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Selection, microinjection, and imaging of fluorescently-labeled F-actin via fluorescent speckle microscopy (FSM).

Imaging cellulare dal vivo di F-actina Dynamics tramite microscopia a fluorescenza Speckle (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Ricerca

Biologia

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions. Extracellular proteins, collagen I or von Willebrand factor are deposited within the microfluidic channel using active perfusion with a pneumatic pump. The matrix proteins are then washed with buffer and blocked to prepare the microfluidic channel for platelet interactions. Whole blood labeled with fluorescent dye is perfused through the channel at various flow rates in order to achieve platelet activation and aggregation. Inhibitors of platelet aggregation can be added prior to the flow cell experiment to generate IC50 dose response data.

The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions.

L&#39;adesione e aggregazione piastrinica in condizioni di flusso utilizzando celle di flusso Microfluidic

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

Etichettatura fluorescente di COS-7 Esprimendo SNAP-tag proteine ​​di fusione per l&#39;imaging cellulare dal vivo

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-cell imaging e analisi quantitativa della embrionali in cellule epiteliali Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

Due-e tridimensionale Live Cell Imaging di proteine ​​danno al DNA di risposta

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

Imaging cellulare dal vivo dei primi autofagia Eventi: Omegasomes e oltre

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

Studiando la proteina del sistema di controllo di qualità di<em&gt; D. discoideum</em&gt; Uso Cellulare Imaging a temperatura controllata

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal epithelium. Despite their physiological importance, enteroendocrine cells represent only a small fraction of the epithelial cell population and in the past, their characterization has presented a considerable challenge resulting in a reliance on cell line models. Here, we provide a detailed protocol for the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary cultures have been used to identify the signaling pathways underlying the stimulation and inhibition of gut peptide secretion in response to a number of nutrients and neuropeptides as well as pharmacological agents. Furthermore, in combination with the use of transgenic fluorescent reporter mice, we have demonstrated that these primary cultures become a powerful tool for the examination of fluorescently-tagged enteroendocrine cells at the intracellular level, using methods such as patch clamping and single-cell calcium and cAMP-FRET imaging.

This protocol describes the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary intestinal cultures enable the investigation of signaling pathways underlying gut peptide secretion using a number of techniques.

Mixed colture primarie di murino tenue finalizzate allo studio di Gut secrezione dell&#39;ormone e imaging cellulare dal vivo di celle enteroendocrine

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic disorder, cardiovascular disease, and kidney disease. Currently, there is no available method to assess LDL uptake while simultaneously monitoring for health of the cells. The current study presents a protocol, using a live cell imaging analysis system, to acquire serial measurements of LDL influx with concurrent monitoring for cell health. This novel technique is tested in three human cell lines (hepatic, renal tubular epithelial, and coronary artery endothelial cells) over a four-hour time course. Moreover, the sensitivity of this technique is validated with well-known LDL uptake inhibitors, Dynasore and recombinant PCSK9 protein, as well as by an LDL uptake promoter, Simvastatin. Taken together, this method provides a medium-to-high throughput platform for simultaneously screening pharmacological activity as well as monitoring of cell morphology, hence cytotoxicity of compounds regulating LDL influx. The analysis can be used with different imaging systems and analytical software.

This protocol provides an efficient approach to measuring LDL cholesterol uptake with real time influx rates using a live cell imaging system in various cell types. This technique provides a platform to screen the pharmacological activity of compounds affecting LDL influx while monitoring for cell morphology and hence potential cytotoxicity.

Analisi di assorbimento di colesterolo LDL utilizzando Live Cell Imaging analisi con cella di monitoraggio dello stato

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...

Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two decades ago and since then continues to contribute greatly to our understanding of the filamentous fungal lifestyle. This paper provides a practical guide for the utilization of the two membrane dyes FM 1-43 and FM 4-64 and the four cell wall stains Calcofluor White M2R, Solophenyl Flavine 7GFE 500, Pontamine Fast Scarlet 48 and Congo Red. The focus is on their low-dose application to ascertain artefact-free staining, their co-imaging properties, and their quantitative evaluation. The presented methods are applicable to all filamentous fungal samples that can be prepared in the described ways. The fundamental staining approaches can serve as starting points for adaptations to species that might require different cultivation conditions. First, biophysical and biochemical properties are reviewed as their understanding is essential for using these dyes as truly vital fluorescent stains. Secondly, step-by-step protocols are presented that detail the preparation of various fungal sample types for fluorescent live-cell imaging. Finally, example experiments illustrate different approaches to: (1) identify defects in the spatio-temporal organization of endocytosis in genetic mutants, (2) comparatively characterize shared and distinct co-localization of GFP-labeled target proteins in the endocytic pathway, (3) identify morphogenetic cell wall defects in a genetic mutant, and (4) monitor cell wall biogenesis in real time.

Vital fluorescent dyes are essential tools for live-cell imaging analyses in modern fungal cell biology. This paper details the application of established and lesser-known fluorescent dyes for tracking plasma membrane dynamics, endo-/exocytosis and cell wall morphogenesis in filamentous fungi.

Applicazione di coloranti fluorescenti selettivi a membrana e a parete cellulare per l'imaging a celle vive di Filamentous Fungi

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...