Questo protocollo consente la quantificazione in cellulo del DNA e la resezione a seguito di danni al DNA. Il principale vantaggio di questa tecnica è la marcatura del ciclo cellulare che limita le cellule alla fase S e G2, assicurando che il segnale bromodeossiuridina derivi dal DNA e dalla resezione. A dimostrare la procedura saranno Jean-Yves Masson, ricercatore principale, e Sofiane Y.Mersaoui, ricercatrice post-dottorato.
Lavorando sotto una cappa di coltura sterile, posizionare un singolo coperchio in ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti per tutte le condizioni necessarie. Piastra circa 150.000 cellule HeLa per la trasfezione o il trattamento farmacologico. Il terzo giorno, dopo l'incubazione notturna con BrdU ad una concentrazione finale di 10 micromolari, irradiare le piastre con una dose totale di cinque grigi di irradiazione a raggi X.
Dopo l'irradiazione, restituire le piastre per l'incubazione a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato al 5% di ossido di carbonio per tre ore. Per la pre-estrazione, aspirare il mezzo e lavare accuratamente le celle due volte con PBS. Dopo aver rimosso PBS, aggiungere due millilitri di tampone di pre-estrazione A e incubare le cellule a quattro gradi Celsius sul ghiaccio per 10 minuti.
Dopo 10 minuti, aspirare il tampone A, aggiungere due millilitri di tampone di stripping del citoscheletro B e ripetere l'incubazione. Quindi aspirare accuratamente il tampone B e lavare le cellule con PBS. Dopo aver aspirato PBS, fissare le celle aggiungendo due millilitri del 4% di paraformaldeide sotto il cappuccio chimico.
Dopo la rimozione della paraformaldeide e lava con PBS, coprire i coverslip con metanolo freddo al 100% per l'incubazione a meno 20 gradi Celsius per cinque minuti e lavare i coverslips due volte con PBS. Per la permeabilizzazione, incubare le cellule con due millilitri di PBS contenenti lo 0,5% di Tritan X-100 a temperatura ambiente. Dopo 15 minuti, lavare le coperture tre volte con due millilitri di PBS.
Per l'immunocolorazione, aggiungere due millilitri di tampone bloccante a ciascun pozzetto. Dopo un'ora di incubazione, aggiungere 100 microlitri di soluzione anticorpale primaria a ciascun coverslip. Utilizzare una pinzetta per coprire le coperture con parafilm quadrato e posizionare con attenzione il parafilm per non creare bolle.
Quindi coprire la piastra in un foglio di alluminio e incubare l'anticorpo primario durante la notte a quattro gradi Celsius in una camera umidificata. Il giorno seguente, rimuovere i quadrati di parafilm e lavare i coperchi tre volte con due millilitri di PBS. Dopo il lavaggio, aggiungere 100 microlitri di soluzione anticorpale secondaria su ogni coverslip e coprire i coverslip con un quadrato di parafilm come dimostrato.
Incubare l'anticorpo secondario a temperatura ambiente per un'ora e proteggere la piastra dalla luce usando un foglio. Quindi lavare le coverslip tre volte con due millilitri di 1X PBS. Per la colorazione nucleare, aggiungere due millilitri di soluzione DAPI a ciascun coperchio e lavare i coperchi con PBS.
Aggiungere da 10 a 20 microlitri di mezzo di montaggio specifico per IF sui vetrini del microscopio. Utilizzare l'ago o una pinzetta fine per sollevare la slitta dal fondo del pozzo. Asciugare accuratamente il liquido in eccesso picchiettando delicatamente un bordo su un tovagliolo di carta e montare i coperchi sui vetrini del microscopio.
Per l'acquisizione e l'analisi delle immagini, importare questi file in CellProfiler e analizzarli utilizzando la pipeline di conteggio delle macchie. Identificare l'oggetto primario per identificare i fuochi utilizzando le impostazioni descritte nel manoscritto di testo e misurare l'intensità. Qui vengono mostrate immagini rappresentative della formazione di focolai di 5-bromo-2-prime-deossiuridina e della colorazione proliferante dell'antigene nucleare cellulare dopo l'irradiazione.
Le tracce di DNA a singolo filamento generate sono state visualizzate come focolai distinti. I focolai identificati sono stati quindi quantificati ed espressi come l'intensità totale integrata della colorazione bromodeossiuridina nei nuclei. La co-colorazione ha mostrato una differenziazione tra la resezione a corto raggio dovuta all'unione finale non omologa e la resezione a lungo raggio della ricombinazione omologa utilizzando un anticorpo anti-PCNA per identificare le cellule che attraversano la fase S.
Il PCNA è prominente nel nucleo e raggiunge la massima espressione durante la fase S del ciclo cellulare con una colorazione piuttosto intensa. I valori risultanti vengono quindi tracciati come un grafico a dispersione per discriminare tra nuclei PCNA positivi e PCNA negativi. I risultati negativi pcNA vengono rimossi dal set di dati per consentire l'analisi basata sull'intensità BrdU a causa del segnale BrdU basso indipendentemente dalla condizione.
I nuclei negativi pcna ospitano un'intensità basale integrata di focolai BrdU di 900 unità arbitrarie e questo valore raggiunge 1.800 UA nei nuclei positivi al PCNA. Nella condizione di controllo del siRNA, l'intensità integrata dei focolai di BrdU per nucleo è di circa 1.500 UA nei nuclei PCNA positivi. Dopo un efficace abbattimento di PARP-1 utilizzando un siRNA, è stato osservato un aumento significativo dell'intensità dei focolai di BrdU a circa 1.900 UA.
Questa tecnica può fornire informazioni chiave sul primo stadio della ricombinazione omologa, aiutando così a identificare se una proteina è coinvolta nella prima fase del percorso di riparazione. Il tempo di incubazione per i tamponi di pre-estrazione deve essere rigorosamente mantenuto. La sovraesposizione a questi tamponi comporterà un eccessivo distacco cellulare e un aumento del segnale di fondo.
