Questo lavoro è stato supportato da una National Institutes of Health di Grant GM 69829.

1. Misura della agonista curve concentrazione-risposta: nessuna attività costitutiva <ol><li> Per la stima dei relativi valori agonista K b (RA i), una serie di almeno due agonista curve concentrazione-risposta è necessaria. Qualsiasi test in vitro per la risposta funzionale di un GPCR può essere misurata a condizione che la concentrazione di agonista può essere controllato e un solo tipo di recettore della risposta media. Adatto saggi cellulari includono la misurazione del cAMP 4,7 e l&#39;accumulo inositolphosphate 8,9 in una linea cellulare che esprime un recettore ricombinante. Esempi di analisi del tessuto intero includono la misurazione della contrazione della muscolatura liscia 10 o M 2 recettori muscarinici e β-1-adrenergico mediato cambiamenti nella contrazione del campo-ratto stimolato sinistra dell&#39;atrio 11. </li><li> Scegli una serie di agonisti per l&#39;analisi tra cui un agonista altamente efficace(Ad esempio, ligando endogeno). In un dato esperimento, misura completa curve concentrazione-risposta per ogni agonista. Se il numero degli agonisti è troppo grande per completare il test in un singolo esperimento, dividere gli agonisti in sottogruppi, ognuno composto da un numero gestibile di agonisti per un singolo esperimento. Per ogni sottogruppo, misurare la curva concentrazione-risposta di un agonista altamente efficace insieme a quelli degli altri agonisti nel sottogruppo (vedi figura 3). Ripetere l&#39;esperimento per ogni sottogruppo 3-6 volte, circa, a seconda della variabilità dei dati. </li><li> Per ogni curva concentrazione-risposta, misurare la risposta in assenza di agonista (risposta basale), e in presenza di concentrazioni crescenti di agonista. Spazio le concentrazioni agonista uniformemente su scala logaritmica circa ogni 0,3-0,7 log 10 unità, che coprono la gamma di risposte e definire la risposta massima (E max) (vedi figura 3). Per experimgenitori su linee cellulari, ogni misurazione è fatta in triplice copia. </li><li> Sottrarre la risposta basale da quello misurato in presenza di ogni concentrazione di agonista. Le risposte tracciate in figura 3 sono stati calcolati in questo modo. </li></ol> 2. Analisi preliminare di agonista curve concentrazione-risposta: nessuna attività costitutiva <ol><li> Inserisci i dati della concentrazione-risposta esperimenti (ad esempio, Figura 5) in una tabella dati in Prism. Tutte le concentrazioni di agonista del registro vengono inseriti nella colonna etichettata X. Le misure di risposta per l&#39;agonista che sembra essere il più grande valore massimo e sono entrato in colonna A, e quelli per l&#39;agonista altri sono entrati in colonne adiacenti lettere. Misurazioni ripetute di una concentrazione curve di risposta sono entrato in sub-colonne di una data colonna lettere. </li><li> Selezionare il foglio grafico su cui sono tracciati i dati e analizzare i dati mediante analisi di regressione lineare utilizzandol&#39;equazione diritto, log (agonista) vs risposta - pendenza variabile (quattro parametri). Vincolare il parametro &quot;Bottom&quot; a zero, ed eseguire l&#39;analisi di regressione. Copiare il &quot;Top&quot; (E max) e log CE 50 parametri in un foglio Excel per l&#39;utilizzo nel calcolo delle stime dei parametri iniziali. L&#39;agonista con la stima più grande E max è designato come il &quot;agonista standard&quot;, mentre gli altri agonisti sono designati come &quot;agonisti di prova&quot;. </li><li> Calcolare la stima iniziale di log τK obs (LOGR1) come negativo log EC 50 valore del agonista standard (-log CE 50 &#39;). Calcolare la stima iniziale della RA log i valore di ogni agonista prova (LOGRA) come log {(* CE Top 50 &#39;) / (Top&#39; * CE 50)}, in cui sono indicati i parametri dei agonista standard con un apostrofo . Calcolare il registro affinità constants degli agonisti prova (LOGK2 - LOGK5) come il registro negativo dei rispettivi valori di EC 50. </li></ol> 3. Stima dei valori agonista Rai usando l&#39;analisi di regressione lineare: nessuna attività costitutiva <ol><li> Inserire i dati in una tabella dati in Prism, come descritto al precedente punto 2.1. Assicurarsi che i dati per l&#39;agonista standard sono inseriti nella colonna A. </li><li> Inserisci definita dall&#39;utente equazione, &quot;log Rai&quot;, in Prisma su diverse linee, come mostrato per il caso che coinvolge un totale di cinque agonisti: <ul><li> &lt;A&gt; P = LOGK1 </li><li> &lt;A&gt; Q = logr </li><li> &lt;~ A&gt; Q = logr + LOGRA </li><li> &lt;B&gt; P = LOGK2 </li><li> &lt;C&gt; P = LOGK3 </li><li> &lt;D&gt; P = LOGK4 </li><li> &lt;E&gt; P = LOGK5 </li><li> Y = MSYS / (1 + {[(1 +10 ^ (X + P)) / (10 ^ (X + Q))]} ^ M) </li></ul></li><li> Inserisci le stime iniziali dei parametri come segue: Inserire un valore arbitrariamente basso pari a 0 per la costante affinità log (LOGK1) della agonista standard. Inserisci la stima iniziale diLogr e le costanti di affinità (LOGK2 - LOGK5) e registrare i valori Rai (LOGRA) degli agonisti prova. Assegnare la stima iniziale del fattore pendenza del trasduttore (M) un valore di 1,0. Assegnare la stima iniziale per la risposta massima del sistema (MSYS) un valore equivalente al massimo E della agonista standard (Top &#39;). </li><li> Applicare i seguenti vincoli parametro: LOGK1 vincolato al costante, 0; LOGR1, MSYS e M, valore condiviso per tutti i set di dati; LOGK2 - LOGK5 e LOGRA, nessun vincolo. </li><li> Avviare l&#39;analisi di regressione lineare. I risultati di rendimento del log K oss e log RA i valori degli agonisti prova. Se l&#39;agonista standard è un agonista completo, quindi il sia il log K oss e registrare i valori di RA sono precisi. Se l&#39;agonista più efficace (agonista standard) è in realtà un agonista parziale, la K oss valori della più efficace agonists può essere sopravvalutato. Tuttavia, le stime di log RA i sono ancora precisi in questa situazione. </li><li> Se la regressione non converge, lo sperimentatore potrebbe voler tracciare la curva teorica definita dalla stime dei parametri iniziali. Se ci sono grandi deviazioni tra i punti dati e le curve teoriche, verificare il calcolo delle stime dei parametri iniziali. Se uno o più agonisti E max valori equivalenti a quello della agonista standard, può essere necessario per limitare i loro log K obs valori a 0 per la regressione a convergere su una soluzione. </li></ol> 4. Misura della agonista curve concentrazione-risposta in saggi cellulari espositrici attività costitutiva del recettore <ol><li> Per la stima dei valori agonista K b in unità assolute di M -1, a base di cellule in vitro sono utilizzati mostrano che l&#39;attività del recettore costitutivo. Costituzionel&#39;attività del recettore tiva è definito come l&#39;aumento della risposta al di sopra del livello basale causato dalla espressione del recettore di interesse. </li><li> Scegli agonisti e progettare l&#39;esperimento, come descritto sopra nella sezione 1.2. </li><li> Per ogni curva concentrazione-risposta, misurare la risposta in assenza di agonista a non transfettate cellule (risposta basale) e in cellule trasfettate con il recettore di interesse (risposta basale + risposta costitutiva). Misurare la risposta in presenza di differenti concentrazioni di agonisti diversi, come descritto sopra nella sezione 1.3. </li><li> Calcolare l&#39;attività costitutiva del recettore e la risposta ad ogni concentrazione di agonista come la risposta misurata meno la risposta basale in cellule non transfettate con il recettore. La Figura 6 illustra le risposte a vari agonisti calcolato in questo modo per una via di segnalazione espone molto bassa attività costitutiva. </li></ol> 5. Preliminare unoANALISI DELLA agonista curve concentrazione-risposta espositrici attività costitutiva <ol><li> Inserire i dati (ad esempio, Figura 6) in una tabella dati in Prism, come descritto nella sezione 3.1, ma anche inserire la risposta causata da attività costitutiva dei recettori nelle varie colonne lettere corrispondenti ad una concentrazione log agonista di -20. Un grande logaritmo negativo è entrato a ravvicinare una concentrazione agonista pari a zero. </li><li> Analizzare i dati come sopra descritto nella sezione 2.2, ma con il parametro &quot;Bottom&quot; costretti in modo che sia &quot;condivisa per tutti i set di dati.&quot; Copiare il &quot;Top&quot; (E max), condiviso &quot;Bottom&quot; e accedere EC50 parametri in un foglio Excel per l&#39;utilizzo nel calcolo delle stime dei parametri iniziali. </li><li> Calcolare le stime dei parametri iniziali come segue: L&#39;affinità log costante del agonista standard (LOGK1) o completa, agonista di prova deve essere determinata in esperimenti separati, come descritto in precedenza 3 </sup&gt;. Calcolare la stima iniziale del log K oss valore di ogni agonista prova parziale (cioè solo LOGK2 in questo caso) come log {(Top&#39;-Top) / (CE 50 (Top&#39;-Bottom))}, in cui &quot;Bottom &quot;indica la reazione causata dall&#39;attivazione del recettore costitutivo. Calcolare la stima iniziale di log K b (LOGKb) per ogni agonista come log {Top / (EC 50 in basso)}. Calcolare la stima iniziale di log τ sistema (LOGTsys) come log {Basso / (Top &#39;- basso)}. </li></ol> 6. Stima dei valori Kb agonista per le risposte esporre l&#39;attività costitutiva del recettore attraverso l&#39;analisi di regressione lineare <ol><li> Inserire i dati in una tabella dati in Prism come sopra descritto ai punti 3.1 </li><li> Inserisci definita dall&#39;utente equazione, &quot;Log Kb&quot;, in Prisma su diverse linee, come indicato per la condizione di due agonisti: <ul><li> &lt;A&gt; LOGKOBS = LOGK1 </li><li> &lt;B&gt; LOGKOBS = LOGK2 </li><li> A = (10 ^ (X + LOGKOBS)) +1 </li><li> B = 10 ^ (X + + LOGTSYS LOGKB) </li><li> C = (10 ^ (LOGTSYS)) </li><li> Y = MSYS / {1 + [(A / (B + C)) ^ M]} </li></ul></li><li> Inserisci le stime iniziali dei parametri come segue: Inserisci le costanti di affinità di ogni agonista (LOGK1 - inserire un valore determinato dalla fase 5.3). Inserisci il K oss stime di ogni agonista prova. Inserisci le stime Kb degli agonisti. Inserisci log τ sistema (LOGTsys) stima. Assegnare il fattore pendenza trasduttore (M) e la risposta massima del sistema (MSYS) i valori di 1,0 e &#39;superiore (E max del agonista standard), rispettivamente. </li><li> Applicare i seguenti vincoli parametro: LOGTsys, MSYS e M, valore condiviso per tutti i set di dati; LOGK2 e LOGKb, nessun vincolo. </li><li> Avviare l&#39;analisi di regressione lineare. I risultati di rendimento del log K b della agonisti standard, il log K obs </sub&gt; e valori di log K b della agonisti parziali, e la risposta massima del sistema (MSYS), il valore τ sistema per il complesso recettore libero (LOGTsys), e il fattore pendenza del trasduttore nel modello operativo (M). </li><li> Se la regressione non converge, seguire la procedura descritta al precedente punto 3.6. </li></ol> 7. Rappresentante Risultati La Figura 5 mostra alcuni dei nostri dati precedentemente pubblicati su agonisti muscarinici indotti idrolisi fosfoinositide in cellule ovariche di criceto cinese esprimono stabilmente il recettore M 3 muscarinici 12. Le curve concentrazione-risposta di selezionati agonisti muscarinici sono stati misurati in questo saggio. I dati sono stati analizzati come descritto sopra nella sezione 3 per stimare il valore K b di ogni agonista, ha espresso rispetto a quello di oxotremorine-M. Questi log RA stime i sono, carbacolo, -0,56 ± 0,063; Arecolinea, -0,60 ± 0,074; pilocarpina, -1,20 ± 0,15 e MCN-A-343, -1,92 ± 0,31. Le curve rappresentano il teorico dei minimi quadrati dell&#39;equazione di regressione dei dati (Sezione 3.2). Le stime corrispondenti della risposta massima del sistema (sistema M) e il fattore pendenza del trasduttore (M) erano 53,9 ± 1,3 e 1,15 ± 0,09, rispettivamente. Il registro K oss valori degli agonisti, diversa da quella del oxotremorine-M sono stati, carbacolo, 5,19 ± 0,14; arecolina, 5,49 ± 0,12; pilocarpina, 5,58 ± 0,16 e MCN-A-343, 5,27 ± 0,33. La Figura 6 illustra i risultati degli esperimenti su agonisti muscarinici idrolisi stimolata fosfoinositide in cellule HEK 293 che esprimono stabilmente G α15 3. Espressione transitoria dei recettori muscarinici 3 M ha causato un aumento di idrolisi fosfoinositide basale, che è stato attribuito al recettore activ costitutivotilità. I dati sono stati analizzati al fine di stimare i valori di log K b del oxotremorine-M e MCN-A-343 come descritto nella sezione 6. Questa analisi ha dato valori di log K b di 8,30 ± 0,59 e 6,59 ± 0,77 per oxotremorine-M e MCN-A-343, rispettivamente. Le curve rappresentano il teorico dei minimi quadrati dell&#39;equazione di regressione per i dati (vedi Sezione 6.2). Le stime di log τ sys, sistemi M e M sono state -2,29 ± 0,59, 95,8 ± 2,8 e 0,72 ± 0,08, rispettivamente. La stima del valore di K oss MCN-A-343 era 5,35 ± 0,46. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3179/3179fig1.jpg" /> Figura 1. Relazione tra l&#39;attività del recettore singolo e il livello medio di attivazione del recettore della popolazione. Recettore singola attività, il comportamento teorico di un solo recettore in fase transitions tra attivo (On) e inattivi (Off) dichiara, in presenza di un agonista è mostrato. Le costanti di affinità l&#39;agonista per gli stati attivi ed inattivi sono indicate con K b e K una, rispettivamente. Comportamenti della popolazione, il comportamento teorico di recettori diversi in fase di transizioni casuali tra gli stati attivi e inattivi in presenza di un agonista è mostrato. Popolazione media, il livello medio di attivazione dei recettori in una popolazione di recettori in presenza di una specifica concentrazione di agonista è mostrato. Il livello di attivazione del recettore popolazione è conosciuto come lo stimolo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3179/3179fig2.jpg" /> Figura 2. Relazione tra la funzione di attivazione del recettore e l&#39;efficacia (ε) e costante osservato affinità (K obs) della agonista. Popolazione media, il livello medio dil&#39;attivazione del recettore suscitato aumentando le concentrazioni di agonista è mostrato. attivazione del recettore, il livello medio di attivazione del recettore agonista è tracciata la concentrazione log di agonista. La concentrazione log negativo di agonista necessaria per la metà-massimale l&#39;attivazione del recettore è equivalente al affinità log osservato costante della agonista (log K obs). Il massimo della funzione di attivazione del recettore è denotato come efficacia (ε). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3179/3179fig3.jpg" /> Figura 3. Esempi di curve concentrazione-risposta per la stimolazione della [3 H] accumulo inositolphosphate da vari agonisti muscarinici in cellule ovariche di criceto cinese che esprime il recettore umano M 3 muscarinici. Un totale di nove agonista curve concentrazione-risposta sono state misurate. L&#39;esperimento può essere diviso in due parti. Per ogni parte, l&#39;agonista standard (oxotremorineM) è sempre testati insieme con agonisti aggiuntivi. Così, due esperimenti del tipo indicato in A e B sono tenuti a misurare le curve concentrazione-risposta di nove agonisti se solo cinque agonisti possono essere analizzati in una volta. I dati sono da Ehlert et al. 12. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3179/3179fig4.jpg" /> Figura 4. Esempi di curve concentrazione-risposta per la stimolazione del [3 H] inositolphosphate accumulo da diversi agonisti muscarinici in HEK 293 cellule che esprimono il recettore M 2 muscarinici e G α15. Espressione del recettore 2 M causato un 30 - 35% [3 H] inositolphosphate risposta, che è stato attribuito alla attività del recettore costitutivo. I dati sono da Ehlert et al. 12. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3179/3179fig5.jpg" /> Figura 5. </strong&gt; muscarinici agonista-mediata idrolisi fosfoinositide in cellule ovariche di criceto cinese esprimono stabilmente l&#39;uomo dei recettori muscarinici M 3. Le curve concentrazione-risposta di selezionati agonisti muscarinici per stimolare l&#39;idrolisi fosfoinositide sono mostrati. I valori medi di tre esperimenti ± SEM sono mostrati. I dati sono da Ehlert et al. 12. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3179/3179fig6.jpg" /> Figura 6. Oxotremorine-M-e MCN-A-343-idrolisi fosfoinositide in HEK 293 cellule che esprimono G α15 e il recettore M 3 muscarinici. Idrolisi fosfoinositide è espressa in relazione al massimo e di oxotremorine-M. In assenza di agonista, idrolisi fosfoinositide attribuito all&#39;espressione del recettore 3 M rappresentato circa il 2% della risposta. I mezzi di tre esperimenti ± SEM sono mostrati. Il data sono da Ehlert et al. 3.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Perché il nostro metodo per la stima RA i (relativo valore di K b) richiede solo la misura della agonista curve concentrazione-risposta, la nostra analisi può essere fatta in qualsiasi momento queste curve sono misurate. Se il giorno per giorno variazione della risposta della preparazione sperimentale (ad esempio, cellule o tessuti) è di grandi dimensioni, le misure di risposta di ogni curva concentrazione-risposta possono essere normalizzati rispetto al pre...

quantifying agonist activity at g protein-coupled receptors

Quando un agonista attiva una popolazione di G recettori accoppiati alla proteina (GPCR), suscita una via di segnalazione che culmina nella risposta della cellula o tessuto. Questo processo può essere analizzato a livello di un solo recettore, una popolazione di recettori, o una risposta a valle. Qui descriviamo come analizzare la risposta a valle di ottenere una stima della costante di affinità agonista per lo stato attivo di singoli recettori. Recettori si comportano come interruttori quantica che si alternano tra gli stati attivi e inattivi (Figura 1). Lo stato attivo interagisce con le proteine ​​G specifiche o altri partner di segnalazione. In assenza di ligandi, lo stato inattivo predomina. Il legame di agonista aumenta la probabilità che il recettore passerà nello stato attivo, perché la sua affinità costante per lo stato attivo (K b) è molto maggiore di quella per lo stato inattivo (K a). La somma deiuscite casuale di tutti i recettori della popolazione produce un costante livello di attivazione dei recettori nel tempo. Il reciproco della concentrazione di agonista suscitando mezza massimo l&#39;attivazione del recettore è equivalente alla costante osservato affinità (K obs), e la frazione di agonista dei recettori complessi nello stato attivo è definita come efficacia (ε) (Figura 2). Metodi per l&#39;analisi delle risposte a valle di GPCR sono stati sviluppati che permettono la stima della K oss e l&#39;efficacia relativa di un 1,2 agonista. In questo rapporto, si mostra come modificare questa analisi per stimare il valore agonista K b rispetto a quello di un altro agonista. Per i saggi che mostrano l&#39;attività costitutiva, mostriamo come stimare K b in unità assolute di M -1. Il nostro metodo di analisi agonista curve concentrazione-risposta 3,4 è costituitoglobale di regressione lineare utilizzando il modello operativo 5. Abbiamo descritto una procedura utilizzando l&#39;applicazione software, Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). L&#39;analisi produce una stima del prodotto di K obs e un parametro proporzionale alla efficacia (τ). La stima del τK obs di un agonista, divise da quella di un altro, è una misura relativa di K b (RA i) 6. Per qualsiasi attività costitutiva del recettore espositrici, è possibile stimare un parametro proporzionale alla efficacia del complesso recettore libero (τ sys). In questo caso, il valore K b di un agonista è equivalente a τK obs / τ sistema 3. Il nostro metodo è utile per valutare la selettività di un agonista per i sottotipi del recettore per la quantificazione e agonista dei recettori segnalazione attraverso diverse proteine ​​G.

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Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors

Un metodo per la stima della costante di affinità di un agonista per lo stato attivo (<em&gt; K<sub&gt; B</sub</em&gt;) Di una proteina-recettore accoppiato G è descritto. L&#39;analisi fornisce misure assoluto o relativo di<em&gt; K<sub&gt; B</sub</em&gt; A seconda che l&#39;attivazione del recettore costitutivo è misurabile. Il nostro metodo si applica a diverse risposte a valle da attivazione del recettore.

Quantificare attività agonista a G recettori accoppiati alla proteina

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell ...

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Research

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Biology

18.2K Views.  University of California, Irvine. Un metodo per la stima della costante di affinità di un agonista per lo stato attivo ( K B

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Dopamine Release at Individual Presynaptic Terminals Visualized with FFNs

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and release from individual presynaptic terminals directly, we designed fluorescent false neurotransmitters as substrates for the synaptic vesicle monoamine transporter. Using these probes to image dopamine release in the striatum, we made several observations pertinent to synaptic plasticity. We found that the fraction of synaptic vesicles releasing neurotransmitter per stimulus was dependent on the stimulus frequency. A kinetically distinct "reserve" synaptic vesicle population was not observed under these experimental conditions. A frequency-dependent heterogeneity of presynaptic terminals was revealed that was dependent in part on D2 dopamine receptors, indicating a mechanism for frequency-dependent coding of presynaptic selection.

Hui Zhang and Niko G. Gubernator contributed equally to this work.

A new means to measure neurotransmission optically using fluorescent dopamine analogs.

Il rilascio di dopamina a singoli terminali presinaptici visualizzate con FFNs

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and ...

Ricerca

Biologia

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial applications as well as increases basic fundamental biological knowledge. F&ouml;rster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET) between a donor molecule in an electronically excited state and a nearby acceptor molecule has been frequently utilized for studies of protein-protein interactions in living cells. The proteins of interest are tagged with two different types of fluorescent probes and expressed in biological cells. The fluorescent probes are then excited, typically using laser light, and the spectral properties of the fluorescence emission emanating from the fluorescent probes is collected and analyzed. Information regarding the degree of the protein interactions is embedded in the spectral emission data. Typically, the cell must be scanned a number of times in order to accumulate enough spectral information to accurately quantify the extent of the protein interactions for each region of interest within the cell. However, the molecular composition of these regions may change during the course of the acquisition process, limiting the spatial determination of the quantitative values of the apparent FRET efficiencies to an average over entire cells. By means of a spectrally resolved two-photon microscope, we are able to obtain a full set of spectrally resolved images after only one complete excitation scan of the sample of interest. From this pixel-level spectral data, a map of FRET efficiencies throughout the cell is calculated. By applying a simple theory of FRET in oligomeric complexes to the experimentally obtained distribution of FRET efficiencies throughout the cell, a single spectrally resolved scan reveals stoichiometric and structural information about the oligomer complex under study. Here we describe the procedure of preparing biological cells (the yeast Saccharomyces cerevisiae) expressing membrane receptors (sterile 2 &alpha;-factor receptors) tagged with two different types of fluorescent probes. Furthermore, we illustrate critical factors involved in collecting fluorescence data using the spectrally resolved two-photon microscopy imaging system. The use of this protocol may be extended to study any type of protein which can be expressed in a living cell with a fluorescent marker attached to it.

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

By employing a spectrally resolved two-photon microscopy imaging system, pixel-level maps of F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiencies are obtained for cells expressing membrane receptors hypothesized to form homo-oligomeric complexes. From the FRET efficiency maps, we are able to estimate stoichiometric information about the oligomer complex under study.

Quantificazione in vivo di G interazioni proteina recettore accoppiato con spettralmente risolte microscopia a due fotoni

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

Receptor Imaging proteina G accoppiata (GPCR)-mediata eventi di segnalazione che chemiotassi di controllo di Dictyostelium discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce informative probes or labels into expressed receptors that do not perturb receptor function. We used amber codon suppression technology to genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine (azF) at various targeted positions in GPCRs heterologously expressed in mammalian cells. The versatility of the azido group is illustrated here in different applications to study GPCRs in their native cellular environment or under detergent solubilized conditions. First, we demonstrate a cell-based targeted photocrosslinking technology to identify the residues in the ligand-binding pocket of GPCR where a tritium-labeled small-molecule ligand is crosslinked to a genetically-encoded azido amino acid. We then demonstrate site-specific modification of GPCRs by the bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligation reaction that targets the azido group using phosphine derivatives. We discuss a general strategy for targeted peptide-epitope tagging of expressed membrane proteins in-culture and its detection using a whole-cell-based ELISA approach. Finally, we show that azF-GPCRs can be selectively tagged with fluorescent probes. The methodologies discussed are general, in that they can in principle be applied to any amino acid position in any expressed GPCR to interrogate active signaling complexes.

We genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine at various targeted positions in GPCRs and show the versatility of the azido group in different applications. These include a targeted photocrosslinking technology to identify residues in the ligand-binding pocket of a GPCR, and site-specific bioorthogonal modification of GPCRs with a peptide-epitope tag or fluorescent probe.

Molecular Probes geneticamente codificati a studiare G recettori accoppiati alle proteine

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors (GPCRs). The onset of a reverse pharmacology assay is the cloning and subsequent transfection of a GPCR of interest in a cellular expression system. The heterologous expressed receptor is then challenged with a compound library of candidate ligands to identify the receptor-activating ligand(s). Receptor activation can be assessed by measuring changes in concentration of second messenger reporter molecules, like calcium or cAMP. The fluorescence-based calcium mobilization assay described here is a frequently used medium-throughput reverse pharmacology assay. The orphan GPCR is transiently expressed in human embryonic kidney 293T (HEK293T) cells and a promiscuous G&#945;16 construct is co-transfected. Following ligand binding, activation of the G&#945;16 subunit induces the release of calcium from the endoplasmic reticulum. Prior to ligand screening, the receptor-expressing cells are loaded with a fluorescent calcium indicator, Fluo-4 acetoxymethyl. The fluorescent signal of Fluo-4 is negligible in cells under resting conditions, but can be amplified more than a 100-fold upon the interaction with calcium ions that are released after receptor activation. The described technique does not require the time-consuming establishment of stably transfected cell lines in which the transfected genetic material is integrated into the host cell genome. Instead, a transient transfection, generating temporary expression of the target gene, is sufficient to perform the screening assay. The setup allows medium-throughput screening of hundreds of compounds. Co-transfection of the promiscuous G&#945;16, which couples to most GPCRs, allows the intracellular signaling pathway to be redirected towards the release of calcium, regardless of the native signaling pathway in endogenous settings. The HEK293T cells are easy to handle and have proven their efficacy throughout the years in receptor deorphanization assays. However, optimization of the assay for specific receptors may remain necessary.

The here described fluorescence-based calcium mobilization assay is a medium-throughput reverse pharmacology screening system for the identification of functionally activating ligand(s) of orphan G protein-coupled receptors (GPCRs).

Caratterizzazione di G recettori accoppiati alla proteina da un calcio di Mobilitazione Assay Basato sulla fluorescenza

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.

Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.

Visualizzazione Clathrin endocitosi mediata da G recettori accoppiati a proteine ​​a risoluzione singolo evento tramite microscopia TIRF

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.

Correlare DNA Modifiche metilazione gene-specifica con espressione e trascrizionale attività di astrociti<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...

Comparative Analysis of Human Growth Hormone in Serum Using SPRi, Nano-SPRi and ELISA Assays

Sensitive and selective methods for the detection of human growth hormone (hGH) over a wide range of concentrations (high levels of 50-100 ng ml&#8722;1 and minimum levels of 0.03 ng ml&#8722;1) in circulating blood are essential as variable levels may indicate altered physiology. For example, growth disorders occurring in childhood can be diagnosed by measuring levels of hGH in blood. Also, the misuse of recombinant hGH in sports not only poses an ethical issue it also presents serious health threats to the abuser. One popular strategy for measuring hGH misuse, relies on the detection of the ratio of 22 kDa hGH to total hGH, as non-22 kDa endogenous levels drop after exogenous recombinant hGH (rhGH) administration. Surface plasmon resonance imaging (SPRi) is an analytical tool that allows direct (label-free) monitoring and visualization of biomolecular interactions by recording changes of the refractive index adjacent to the sensor surface in real time. In contrast, the most frequently used colorimetric method, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) uses enzyme labeled detection antibodies to indirectly measure analyte concentration after the addition of a substrate that induces a color change. To increase detection sensitivity, amplified SPRi uses a sandwich assay format and near infrared quantum dots (QDs) to increase signal strength. After direct SPRi detection of recombinant rhGH in spiked human serum, the SPRi signal is amplified by the sequential injection of detection antibody coated with near-infrared QDs (Nano-SPRi). In this study, the diagnostic potential of direct and amplified SPRi was assessed for measuring rhGH spiked in human serum and compared directly with the capabilities of a commercially available ELISA kit.

The proposed work assesses the diagnostic potential of direct and amplified surface plasmon resonance imaging (SPRi) assays, particularly for the detection of recombinant human growth hormone in spiked human serum, by comparing SPRi results directly with commercially available enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit.

Analisi comparativa di ormone umano della crescita nel siero Utilizzando SPRI, Nano-SPRI e saggi ELISA

Sensitive and selective methods for the detection of human growth hormone (hGH) over a wide range of concentrations (high levels of 50-100 ng ml&#8722;1 ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Imaging G protein-coupled recettore-mediata chemiotassi ed i suoi eventi di segnalazione nelle cellule HL60 neutrofili-like

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent fusion proteins, such as green fluorescent protein (GFP), to determine their expression, localization, and function. The subcellular localization of target proteins is important for identification, characterization, and functional analyses. Internalization is one of the predominant mechanisms controlling G protein-coupled receptor (GPCR) signaling to ensure the appropriate cellular responses to stimuli. Here, we describe an experimental method to detect the subcellular localization and internalization of GPCR in HEK293 cells with confocal microscopy. In addition, this experiment provides some details about cell culture and transfection. This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescent markers and is applicable to the visualization of the subcellular localization of a majority of proteins, as well as of the internalization of GPCR. This technique should enable researchers to efficiently manipulate GPCR gene expression in mammalian cell lines and should facilitate studies on GPCR subcellular localization and internalization.

This protocol describes confocal microscopy detection of G protein-coupled receptor (GPCR) internalization in mammalian cells. It includes the basic cell culture, transfection, and confocal microscopy procedure and provides an efficient and easily interpretable method to detect the subcellular localization and internalization of fusion-expressed GPCR.

Rilevamento di Ligand-activated proteina G-recettore accoppiato internalizzazione da microscopia confocale

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...

Methods Article

Quantificare attività agonista a G recettori accoppiati alla proteina