Gli autori ringraziano Céline Jeanty per la sua assistenza nella creazione di pellet cellulari con trattamento di MG-132 come descritto nei risultati rappresentativi e Elise Mommaerts per la sua fornitura di pellet E. coli utilizzati nel protocollo.

1. Preparazione di uno standard peptidico pesante
<ol><li>A seconda del fornitore e della qualità dei peptidi pesanti acquistati, i peptidi pesanti dovranno essere diluiti. Questo protocollo utilizzava le sequenze peptidiche riportate nella tabella 1, con l'amminoacido C-terminale modificato in lisina(13C615N2-lisina) o arginina (13C615N4-arginina).<ol>
<li>Mescolare i peptidi pesanti, diluire il mix con acetonitrile al 50% (ACN) per creare un mix peptidico con ogni peptide a 10 μM.</li>
		<li>Creare aliquote del mix peptidico e conservare a -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparazione del campione
<ol><li>Lisi campione NOTA: La stabilità delle catene di ubiquitina deve essere considerata durante la preparazione del campione. Conservare i campioni biologici e i tamponi refrigerati a 4 °C e aggiungere campioni al tampone di stabilizzazione dell'ubiquitina il più rapidamente possibile.<ol>
<li>Preparare una soluzione di 1 M NH4HCO3 (bicarbonato di ammonio) in acqua e regolare il pH a 8 utilizzando 1 M NaOH.</li>
		<li>Preparare una soluzione di 200 mM N-etilmaleimide (NEM) in acqua.</li>
		<li>Preparare il buffer di stabilizzazione dell'ubiquitina utilizzando 8 M urea in 50 mM NH4HCO3/10 mM NEM. NOTA: Una soluzione da 5 mL di urea da 8 M richiederà considerevolmente meno di 5 mL di acqua data l'espansione dell'acqua quando si è in una soluzione satura con urea. ATTENZIONE: Non preparare il tampone sopra i 50 °C a causa della tendenza dell'urea a formare poliurea ad alte temperature.</li>
		<li>Resuspend il campione biologico da esaminare in tampone di stabilizzazione dell'ubiquitina con l'obiettivo di 0,5 μg/μL di proteine e di leccare le cellule con un metodo appropriato per il campione. Un metodo di sonicazione composto da tre impulsi da 10 s con un sonificatore SFX 150 Branson impostato al 70% di intensità con 10 s di pause sul ghiaccio tra ogni impulso, è stato utilizzato per le linee cellulari in questo protocollo.</li>
		<li>Campione di centrifuga a 18.000 x g per 10 min a 4 °C in una centrifuga da tavolo.</li>
		<li>Trasferire il supernatante in un tubo di microcentrifugo fresco a basso legame proteico. I campioni possono essere conservati a -20 °C a questo punto, se necessario.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione del campione e dei controlli
	<ol>
<li>Se i campioni sono congelati, mescolare (ad esempio, con un termomixer) mentre vengono scongelati per sciogliere rapidamente l'urea. ATTENZIONE: Non utilizzare temperature superiori a 50 °C a causa della tendenza dell'urea a formare poliurea ad alte temperature.</li>
		<li>Campione di centrifuga a 18.000 x g per 10 min a 4 °C in una centrifuga da tavolo.</li>
		<li>Trasferire 20 μg di campione in un nuovo tubo di microcentrifugo a bassa lega e regolare il volume a 50 μL con tampone di stabilizzazione dell'ubiquitina.</li>
		<li>Creare un controllo negativo utilizzando un volume normalizzato di buffer di stabilizzazione dell'ubiquitina (50 μL). In questo campione non deve essere presente alcuna versione leggera di ciascun peptide, consentendo l'osservazione di qualsiasi contaminazione leggera derivante dai peptidi pesanti a spillo. Questo controllo negativo è stato utilizzato anche per la pianificazione del tempo di conservazione del PRM descritto nella sezione 3.1.</li>
		<li>È stato anche creato un controllo positivo con buffer di stabilizzazione dell'ubiquitina e l'aggiunta di tipi di catena disponibili in commercio al volume normalizzato di buffer di stabilizzazione dell'ubiquitina (50 μL). Comunemente, K63, K48 e M1 sono disponibili. Nei risultati rappresentativi sono stati utilizzati 20 ng di K48, K63 e M1.</li>
	</ol></li>
	<li>Riduzione, alchilazione e digestione
	<ol>
<li>Preparare una soluzione di bicarbonato di ammonio da 50 mM (NH4HCO3) in acqua e regolare il campione in pH = 8 con 1 M NaOH.</li>
		<li>Una coltura di E. coli coltivata in brodo LB è stata centrifugata 5.000 x g per 5 minuti per formare un pellet, che è stato poi lavato 2 volte con PBS prima della resuspensione in tampone di stabilizzazione ubiquitina a 5 μg/μL.</li>
		<li>Aggiungere 1 μg di E. coli lysate a ciascun campione e controllare. Questo protocollo utilizza E. coli (DH10B), ma è possibile utilizzare qualsiasi lisato complesso senza ubiquitina. Si noti che l'ubiquitina è comune a tutti gli eucarioti. NOTA: L'uso di una matrice di lisato E. coli riduce la perdita di peptidi a causa dell'adesione non specifica alle stoviglie. Ciò è particolarmente evidente nel controllo negativo o nei campioni con un contenuto proteico limitato e ha un forte impatto sull'osservazione di K6312.</li>
		<li>Preparare una soluzione di 500 mM tris(2-carbossietile)fosfina (TCEP) in acqua di grado MS (DTT può essere utilizzato come alternativa).</li>
		<li>Ridurre i campioni e i controlli con l'aggiunta di TCEP a una concentrazione finale di 50 mM. Vortice brevemente prima di incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (RT). Se si utilizza DTT, la temperatura deve essere elevata a 50 °C. ATTENZIONE: Non utilizzare temperature superiori a 50 °C a causa della tendenza dell'urea a formare poliurea ad alte temperature.</li>
		<li>Preparare una soluzione di 550 mM di cloroacetamide (CAA) in NH4HCO3. Conservare al buio.</li>
		<li>Alchilato i campioni e i controlli aggiungendo CAA ad una concentrazione finale di 55 mM. Vortice brevemente prima di incubare per 20 minuti a RT al buio. NOTA: CAA viene utilizzato al posto dell'iodoacetamide come agente di riduzione per ridurre la possibilità di una doppia modifica carbamidometile (114.0429) su un residuo di lisina scambiato per una modifica -GG (114.0429)13.</li>
		<li>Aggiungere l'endopeptidasi LysC ai campioni con un rapporto 1:25 (w/w) con il contenuto proteico. Incubare per 3 ore a 37 °C.</li>
		<li>Diluire i campioni e i comandi con 200 μL di 50 mM NH4HCO3 pH = 8 (1:5 v/v).</li>
		<li>Aggiungere la tripsidena ai campioni con un rapporto di 1:25 w/w con il contenuto proteico. Incubare per 12 ore a 37 °C.</li>
		<li>Aggiungere la soluzione di acido formico (FA) al 10% in acqua di grado MS con un rapporto 1:10 v/v a ciascun campione e campione di controllo. Verificare che il pH sia <3) prima della pulizia C18 e aggiungere altro acido formico, se necessario.</li>
		<li>Ad ogni campione e controllo aggiungere 0,5 μL dello standard peptidico pesante creato nella sezione 1.</li>
	</ol></li>
	<li>Pulizia peptidica
	<ol>
<li>Diversi produttori offrono punte o piastre di pulizia C18. Seguire le istruzioni del produttore per il prodotto utilizzato e i peptidi elusi secchi in una centrifuga sottovuoto, pronti per l'analisi ms.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Analisi di LC-MS/MS
<ol><li>Esegui l'analisi PRM iniziale sullo standard peptidico pesante in modo non programmato.<ol>
<li>Resuspend i campioni essiccati in 10 μL di tampone di carico MS 2% ACN/0,05% acido trifluoroacetico (TFA).</li>
		<li>Equipaggia un HPLC con una colonna analitica C18 in fase inversa (75 μm x 15 cm, 2 μm 100 Å C18 perline) progettata per il nanoflusso MS. Una colonna trappola sacrificale (75 μm x 2 cm, 3 μm, 100 Å C18 perline) per preservare la vita della colonna analitica è stata utilizzata qui ma non è richiesta.</li>
		<li>Accoppiare l'output della colonna analitica a una sorgente nano-ESI su uno spettrometro di massa ad alta risoluzione.</li>
		<li>Utilizzare un metodo di proteomica mirato appropriato per lo spettrometro di massa. Ad esempio, su un Q-Exactive più un metodo a due esperimenti, scorrere tra un full MS e un esperimento PRM. Per l'esperimento Full MS è stata utilizzata una risoluzione di 120.000 con un obiettivo AGC di 1e6 e 240 ms come IT massimo. Per l'esperimento PRM, lo stesso obiettivo AGC e l'IT massimo sono stati utilizzati con una risoluzione inferiore di 60.000 e una finestra di isolamento di 1,2 m/z.</li>
		<li>Iniettare 200 ng del controllo negativo sulla colonna analitica utilizzando l'autocampionatore HPLC. Applicare un gradiente lineare al campione sulla colonna analitica aumentando la concentrazione di ACN dal 2 al 25% in un periodo di ~45 min. NOTA: La concentrazione di ACN del 25% è inferiore al solito per la proteomica a causa della bassa natura idrofila dei tipici peptidi caratteristici della topologia dell'ubiquitina. Se altri peptidi devono essere quantificati, si può desiderare una maggiore concentrazione di ACN per ottenere una buona separazione del bersaglio.</li>
		<li>Analizzare i risultati dell'esecuzione della programmazione come descritto nella sezione 4.2 per creare un elenco di inclusione pianificato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analisi dei campioni<ol>
<li>Eseguire gli esempi rimanenti come descritto per la programmazione in 3.1 a parte l'utilizzo dell'elenco di inclusione pianificato creato nella sezione 4.2. NOTA: un vuoto deve essere eseguito dopo il controllo positivo per garantire che non venga rilevato alcun riporto dall'esecuzione precedente nei campioni successivi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Analisi del software
<ol><li>Creare un elenco di inclusione della formattazione appropriata per l'MS utilizzato. Questo protocollo utilizzava il software open source Skyline (versione 19.1.0.193) (https://skyline.ms), che offre supporto e aiuto ben documentati. È possibile creare un elenco di inclusione per diversi spettrometri di massa utilizzando la struttura dell'elenco di isolamento delle esportazioni.<ol>
<li>Aprire un nuovo documento Skyline.</li>
		<li>Selezionare modifiche isotopiche pesanti in base alle esigenze dei peptidi caratteristici della topologia pesante. In Impostazioni| Impostazioni peptidice nella scheda Modifica fare clic sul campo nome per visualizzare la potenziale modifica. La selezione si basa sullo stato isotopico dei peptidi pesanti acquistati. In questo esempio sono stati utilizzati peptidi sintetici che trasportano una lisina pesante (13C615N2-lisina) o un'arginina pesante(13C615N4-arginina) al C-terminale. Le etichette appropriate sarebbero: "Label:13C(6)15N(2) (C-term K)" e "Label:13C(6)15N(4) (C-term R)".</li>
		<li>Selezionare Impostazioni| Transizione. Nella scheda Filtro sono includono Precursor Charges 2, 3, 4.</li>
		<li>Inserire peptidi selezionando Modifica| Inserisci| Peptidi.</li>
		<li>Compilare i campi rilevanti, inclusa la sequenza peptidica caratteristica della topologia e un nome proteico (ad esempio, "Catena-K63").</li>
		<li>Espandete ogni peptide ora mostrato nel pannello Bersagli. Eliminare gli stati di addebito indesiderati. Lo stato di carica preferito e l'energia di collisione, che possono differire in base allo spettrometro di massa utilizzato, per ogni peptide caratteristico della topologia è mostrato nella tabella 1.</li>
		<li>Per ogni peptide caratteristico della topologia (ad eccezione di M1 in cui il GG è incluso nella sequenza), fare clic con il pulsante destro del mouse sulla sequenza e scegliere Modifica. Aggiungere un GG come modifica strutturale facendo clic sul campo nome e selezionando <Mostra tutto... > prima di selezionare "GlyGly (K)".</li>
		<li>Esportare l'elenco di isolamento File| Esporta| Elenco diisolamento , selezionare il tipo di strumento e impostare il tipo di metodo su Standard. Selezionando OK verrà aperto un prompt per salvare un file *.csv che può essere utilizzato per creare un metodo PRM.</li>
	</ol></li>
	<li>Crea un elenco di inclusione pianificato basato su un'esecuzione di pianificazione peptidica pesante spiegata qui utilizzando il software Skyline open source.<ol>
<li>Creare un elenco di destinazione come descritto nella sezione 4.1.</li>
		<li>Importare l'esecuzione della pianificazione in 3.1 selezionando File| Importa| Risultati.</li>
		<li>Rivedere le identificazioni. Il segnale pesante per ogni peptide è osservabile cliccando sulla massa per ogni ingresso peptidico pesante. Il corretto riconoscimento del picco viene spesso determinato automaticamente, ma il software potrebbe richiedere la cura manuale selezionando il picco utilizzando il clic e il trascinamento sotto l'asse x.</li>
		<li>I tempi di ritenzione selezionati per le varianti pesanti vengono applicati anche alle versioni leggere, creando così una pianificazione per il PRM. La finestra di pianificazione può essere modificata in Impostazioni| Impostazioni peptidiche mediante la scheda Previsione, modificando la finestra di tempo.</li>
		<li>Un elenco di inclusione pianificato può ora essere esportato utilizzando File| Esporta| Elenco di isolamento e selezione del tipo di strumento appropriato e impostazione del tipo di metodo su Programmato.</li>
	</ol></li>
	<li>Analizzare i dati.<ol>
<li>Importare i campioni nello stesso modo dell'analisi di esecuzione della programmazione nella sezione 4.2.</li>
		<li>Dopo l'importazione completa di tutti i campioni, si consiglia la cura delle transizioni. Questo è il processo attraverso il quale vengono rimosse le transizioni con interferenze o scarsi rapporti segnale-rumore. Un esempio di cromatogramma prima e dopo la cura è illustrato nella figura 4.</li>
		<li>I dati possono ora essere esportati facendo clic con il pulsante destro del mouse sui grafici pertinenti e selezionando Copia dati o selezionando File| Esporta| Risultati.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+post-translational+modification+statistics:+frequency+analysis+and+curation+of+the+swiss-prot+database.">Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database.</a> Scientific Reports. 1, 90 (2011).</li><li>Goldstein, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+polypeptide+that+has+lymphocyte-differentiating+properties+and+is+probably+represented+universally+in+living+cells.">Isolation of a polypeptide that has lymphocyte-differentiating properties and is probably represented universally in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (1), 11-15 (1975).</li><li>Glickman, M. H., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+proteolytic+pathway:+Destruction+for+the+sake+of+construction.">The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: Destruction for the sake of construction.</a> Physiol. Rev. 82, 373-428 (2002).</li><li>Pickart, C. M., Eddins, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin:+structures,+functions,+mechanisms.">Ubiquitin: structures, functions, mechanisms.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1695 (1-3), 55-72 (2004).</li><li>Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+chain+diversity+at+a+glance.">Ubiquitin chain diversity at a glance.</a> Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).</li><li>Komander, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ubiquitin+Code.">The Ubiquitin Code.</a> Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).</li><li>Mattern, M., Sutherland, J., Kadimisetty, K., Barrio, R., Rodriguez, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Ubiquitin+Binders+to+Decipher+the+Ubiquitin+Code.">Using Ubiquitin Binders to Decipher the Ubiquitin Code.</a> Trends in Biochemical Sciences. 44 (7), 599-615 (2019).</li><li>Newton, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+chain+editing+revealed+by+polyubiquitin+linkage-specific+antibodies.">Ubiquitin chain editing revealed by polyubiquitin linkage-specific antibodies.</a> Cell. 134 (4), 668-678 (2008).</li><li>Spence, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle-regulated+modification+of+the+ribosome+by+a+variant+multiubiquitin+chain.">Cell cycle-regulated modification of the ribosome by a variant multiubiquitin chain.</a> Cell. 102 (1), 67-76 (2000).</li><li>Borr&#224;s, E., Sabid&#243;, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+targeted+proteomics?+A+concise+revision+of+targeted+acquisition+and+targeted+data+analysis+in+mass+spectrometry.">What is targeted proteomics? A concise revision of targeted acquisition and targeted data analysis in mass spectrometry.</a> PROTEOMICS. 17 (17-18), (2017).</li><li>Lesur, A., Domon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+high-resolution+accurate+mass+spectrometry+application+to+targeted+proteomics.">Advances in high-resolution accurate mass spectrometry application to targeted proteomics.</a> PROTEOMICS. 15 (5-6), 880-890 (2015).</li><li>Longworth, J., Dittmar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Ubiquitin+Chain+Topology+by+Targeted+Mass+Spectrometry.">Assessment of Ubiquitin Chain Topology by Targeted Mass Spectrometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1977, 25-34 (2019).</li><li>Nielsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iodoacetamide-induced+artifact+mimics+ubiquitination+in+mass+spectrometry.">Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry.</a> Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).</li><li>Tawa, N. E., Odessey, R., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+the+proteasome+reduce+the+accelerated+proteolysis+in+atrophying+rat+skeletal+muscles.">Inhibitors of the proteasome reduce the accelerated proteolysis in atrophying rat skeletal muscles.</a> The Journal of Clinical Investigation. 100 (1), 197-203 (1997).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome.">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Collision+Energy+Optimization+on+the+Measurement+of+Peptides+by+Selected+Reaction+Monitoring+(SRM)+Mass+Spectrometry.">Effect of Collision Energy Optimization on the Measurement of Peptides by Selected Reaction Monitoring (SRM) Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 82 (24), 10116-10124 (2010).</li></ol>

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

L'analisi dello stato di ubiquitina all'interno di un proteoma è sempre più importante per un'ampia varietà di questioni biologiche. La descrizione dello stato di ubiquitinazione di un campione deve concentrarsi non solo sul profilo delle proteine ubiquitinate, ma anche sulla topologia di tale ubiquitinazione. La valutazione di questa topologia da parte degli Stati membri mirati, come descritto in questa sede, ha un ruolo in un'ampia gamma di indagini biologiche.
Va capito che il protocollo...

La stretta regolazione della funzione e della stabilità proteica è di fondamentale importanza, in quanto sono i principali motori del controllo fenotipico della biologia. La funzione di una proteina è costruita da due componenti: la sua sequenza intrinseca di polipeptidi e qualsiasi modificazione posttraslazionale (PTM). Sono state identificate varie PTM chimiche tra cui glicosilazione, fosforilazione, acetilazione e metilazione1. Nel 1975, Goldstein etal. L'ubiquitina è stata trovata importante nella degradazione delle proteine3. Tuttavia, da allora è stato stabilito che la funzione dell'ubiquitina come molecola di segnalazione si estende ben oltre la regolazione della stabilità proteica. La segnalazione dell'ubiquitina è coinvolta in una vasta gamma di altre funzioni biologiche, come la stabilizzazione delle proteine, l'autofagia, il controllo del ciclo cellulare e il trafficoproteico 4.
Mentre altre PTM sono generalmente binarie (cioè, la proteina viene modificata o lasciata non modificata) per un dato sito, l'ubiquitina può modificare una proteina sia come monomero che come catena polimerica, con l'ubiquitinazione stessa attaccata. Inoltre, questa catena di poliubiquitinazione può svilupparsi in diverse topologie con l'ubiquitinazione della precedente ubiquitina allegandosi a uno degli otto siti di collegamento5,6. L'ubiquitina viene trasferita da un processo enzimatico multipasso (Figura 1) in cui il C-terminale dell'ubiquitina è collegato a uno dei suoi sette residui di lisina (K06, K11, K27, K29, K33, K48 o K63) o all'N-terminale dell'ubiquitina precedente (indicato come m1 o ubiquitinazione lineare)5,6. Questa topologia a catena è la chiave del destino della proteina in fase di modifica. Ad esempio, la modifica con una catena collegata K48 o K11 porta alla degradazione della proteina modificata al proteasome, mentre una catena lineare è necessaria per l'attivazione della segnalazione NF-kB. Pertanto, la distribuzione relativa di queste topologie a catena è rilevante per un'ampia varietà di questioni biologiche.
L'uso della spettrometria di massa (SM) è di particolare beneficio per l'analisi della topologia della catena di ubiquitina in quanto non dipende da interazioni basate suanticorpi o affinità 7,8, molte delle quali hanno una specificità limitata e non distinguono tra i vari tipi di catena. Un'altra possibilità di rilevamento è l'uso di mutanti ubiquitina geneticamente modificati. Qui, una lysina specifica viene scambiata con arginina, che non può supportare la modifica con ubiquitina. La mancanza di formazione di catena di ubiquitina sulla proteina del substrato viene quindi interpretata come prova di una topologiaspecifica 9.
L'identificazione basata sulla SM delle proteine ubiquitinate si basa sul fatto che il C-terminale dell'ubiquitina contiene un residuo di arginina nella posizione 74 che è riconosciuto dalla trippasina durante la preparazione proteolitica dei campioni per l'analisi MS, separando la doppia glicina C-terminale. Questo GlyGly (-GG) rimane attaccato al ε-ammino del residuo di lisina della proteina del substrato. Per l'analisi della topologia dell'ubiquitina, la modifica avviene su uno dei sette residui di lisina dell'ubiquitina. In questo modo viene creato un insieme di sette peptidi chiave che trasportano un residuo di lisina modificato da GG, specifico per ciascuna delle topologie (Figura 2). Ad esempio, con la topologia K06, la lisina in posizione 6 sulla sequenza amminoacido sarà protetta dalla digestione triptica con una modifica -GG di 114 Da aggiunta a questa lisina.
L'identificazione di peptidi predeterminati specifici da parte della SM è indicata come proteomica mirata, o più specificamente, acquisizione mirata di peptidi10. Sono stati sviluppati due metodi a seconda delle prestazioni dello spettrometro di massa utilizzato. Questi sono il monitoraggio della reazione selezionata (SRM), chiamato anche monitoraggio della reazione multipla (MRM) e monitoraggio della reazione parallela (PRM). L'SRM comporta la selezione di transizioni costituite dal precursore m/z e dal prodotto ione m/z. Al contrario, il PRM richiede solo il precursore m/z. Dopo la selezione, viene eseguita una scansione completa del sondaggio degli ioni prodotto. Ciò ha il vantaggio che non è necessaria alcuna selezione di ioni di prodotto appropriati per la quantificazione sullo spettrometro di massa specifico prima della misurazione11. Sia SRM che PRM possono, a seconda dello strumento, essere programmati. La programmazione è la pratica di assegnare un lacime temporale durante il quale un particolare ione sarà incluso per l'analisi, poiché i peptidi stanno eluendo in tempi di conservazione definiti dal sistema cromatografico. La riduzione del numero di ioni interrogati in un dato momento aumenta la frequenza di interrogatorio degli ioni programmati in quel momento, migliorando così l'accuratezza dei dati.
In generale, l'applicazione di proteomica mirata per la topologia dell'ubiquitina è la stessa di qualsiasi altro esperimento di proteomica mirato. Tuttavia, due differenze chiave sono importanti: in primo luogo, deve essere considerata la stabilità delle catene di ubiquitina. Ci sono più potenti enzimi deubiquitinanti (DBA) che degradano rapidamente le catene sulla lisi cellulare. Le proteasi ubiquitina-specifiche si suddividono in due categorie: le tioesterasi e le metalloproteasi. La maggior parte delle ubiquitina-idrolasi sono tioesterasi e trasportano un residuo di cisteina nel loro centro attivo. Alchilando questo residuo di cisteina, possono essere inattivati. Come tale, l'uso di tamponi di stabilizzazione dell'ubiquitina contenenti agenti alchilanti, come la N-etilmaleimide (NEM), e sostanze chimiche altamente denaturanti, e mantenere i campioni refrigerati è vitale per un'analisi di successo. In secondo luogo, a differenza di altri esperimenti mirati, la scelta peptidica è fissa. In un tipico esperimento mirato, un peptide proteotipico può essere selezionato per buone prestazioni cromatografiche e ionizzazioni. Per alcuni peptidi caratteristici della topologia come K48 queste proprietà sono buone, mentre per altre sono meno desiderabili. Ad esempio, la cromatografia K33 in una tipica configurazione in fase inversa è scarsa a causa della formazione di un profilo di eluizione allungato e le scarse proprietà di ionizzazione del peptide K27 riducono la sua visibilità di MS12.
In questo protocollo, descriviamo come eseguire la valutazione della topologia dell'ubiquitina di un campione biologico da parte del PRM. I dati di esempio per la procedura sono presentati utilizzando una perturbazione del proteasome utilizzando il trattamento inibitore MG-132 in diversi tipi di cellule.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (ACN)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate (ABC)</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Microfuge 16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroacetamide (CAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>22790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf LoBind</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (FA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>85178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heavy Peptides</td>
			<td>JPT Peptide Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Ulitimate 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>160321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lys C</td>
			<td>Wako</td>
			<td>125-05061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q-Exactive Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide (NEM)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>156100050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Control Chain K48</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>UC-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Control Chain K63</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>UC-340-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Control Chain M1</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>UC-710B-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifier</td>
			<td>Branson sonifier</td>
			<td>SFX 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Thermomixer Comfort</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigam</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>77720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V1511A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters &#956;Elution C18 plates</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002318</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ubiquitin chain analysis by parallel reaction monitoring

La valutazione del profilo globale delle topologie a catena di ubiquitina all'interno di un proteoma è interessante per rispondere a un'ampia gamma di domande biologiche. Il protocollo qui delineato sfrutta la modifica della diglicina (-GG) lasciata dopo la digestione triptica dell'ubiquitina incorporata in una catena. Quantificando questi peptidi caratteristici della topologia si può determinare l'abbondanza relativa di ogni topologia a catena di ubiquitina. Le misure necessarie per quantificare questi peptidi mediante un esperimento parallelo di monitoraggio della reazione sono riportate tenendo conto della stabilizzazione delle catene di ubiquitina. La preparazione di controlli pesanti, lisi cellulare e digestione sono descritti insieme all'appropriata configurazione dello spettrometro di massa e al flusso di lavoro di analisi dei dati. Viene presentato un set di dati di esempio con perturbazioni nella topologia ubiquitina, accompagnato da esempi di come l'ottimizzazione del protocollo può influire sui risultati. Seguendo i passaggi descritti, un utente sarà in grado di eseguire una valutazione globale del paesaggio della topologia dell'ubiquitina all'interno del proprio contesto biologico.

Per dimostrare l'uso di un'analisi della catena di ubiquitina da parte del PRM, sono state selezionate tre linee cellulari: una linea cellulare di melanoma del topo B16 e le due comuni linee cellulari umane A549 (cellule epiteliali basali alveolari adenocarcinomiche) e HeLa (cellule tumorali cervicali). Queste colture sono cresciute fino alla fase semiesonziale in mezzi appropriati prima di essere trattate con 0, 10 o 100 mM MG-132 per 4 ore prima della raccolta. MG-132 è un inibitore del proteasome che impedisce la deg...

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Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Questo metodo descrive la valutazione dei cambiamenti globali nella topologia della catena di ubiquitina. La valutazione viene eseguita mediante l'applicazione di un approccio di proteomica mirata basato sulla spettrometria di massa.

Analisi della catena Ubiquitin mediante monitoraggio parallelo della reazione

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

3.4K Views.  Luxembourg Institute of Health. Questo metodo descrive la valutazione dei cambiamenti globali nella topologia della catena di ubiquitina. La valutazione viene eseguita mediante l'applicazione di un approccio di proteomica mirata basato sulla spettrometria di massa.

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2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of protein-protein interactions (PPI) is no novelty, experimental approaches aiming to characterize endogenous protein-metabolite interactions (PMI) constitute a rather recent development. Herein, we present a protocol that allows simultaneous characterization of the PPI and PMI of a protein of choice, referred to as bait. Our protocol was optimized for Arabidopsis cell cultures and combines affinity purification (AP) with mass spectrometry (MS)-based protein and metabolite detection. In short, transgenic Arabidopsis lines, expressing bait protein fused to an affinity tag, are first lysed to obtain a native cellular extract. Anti-tag antibodies are used to pull down protein and metabolite partners of the bait protein. The affinity-purified complexes are extracted using a one-step methyl tert-butyl ether (MTBE)/methanol/water method. Whilst metabolites separate into either the polar or the hydrophobic phase, proteins can be found in the pellet. Both metabolites and proteins are then analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS or UPLC-MS/MS). Empty-vector (EV) control lines are used to exclude false positives. The major advantage of our protocol is that it enables identification of protein and metabolite partners of a target protein in parallel in near-physiological conditions (cellular lysate). The presented method is straightforward, fast, and can be easily adapted to biological systems other than plant cell cultures.

Protein-protein and protein-metabolite interactions are crucial for all cellular functions. Herein, we describe a protocol that allows parallel analysis of these interactions with a protein of choice. Our protocol was optimized for plant cell cultures and combines affinity purification with mass spectrometry-based protein and metabolite detection.

2 in 1: purificazione di affinità per l'analisi parallela di proteina-proteina e proteina-metabolita complessi in un unico passaggio

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Ricerca

Biochimica

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded in the thylakoid membrane harvest solar energy to drive electrons from water to NADP+ via two photosystems, and use the created proton gradient for production of ATP. Photosystem PSII, PSI, cytochrome b6f (Cyt b6f) and ATPase are all multiprotein complexes with distinct orientation and dynamics in the thylakoid membrane. Valuable information about the composition and interactions of the protein complexes in the thylakoid membrane can be obtained by solubilizing the complexes from the membrane integrity by mild detergents followed by native gel electrophoretic separation of the complexes. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) is an analytical method used for the separation of protein complexes in their native and functional form. The method can be used for protein complex purification for more detailed structural analysis, but it also provides a tool to dissect the dynamic interactions between the protein complexes. The method was developed for the analysis of mitochondrial respiratory protein complexes, but has since been optimized and improved for the dissection of the thylakoid protein complexes. Here, we provide a detailed up-to-date protocol for analysis of labile photosynthetic protein complexes and their interactions in Arabidopsis thaliana.

A protocol for the elucidation of plant thylakoid protein complex organization and composition with blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) and 2D-SDS-PAGE is described. The protocol is optimized for Arabidopsis thaliana, but can be used for other plant species with minor modifications.

Analisi dei complessi della proteina di membrana tilacoide mediante elettroforesi nativa blu

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament on single-stranded DNA (ssDNA) and captures double-stranded DNA (dsDNA) non-specifically to interrogate it for a homologous sequence. After encountering homology, Rad51 catalyzes DNA strand exchange to mediate pairing of the ssDNA with the complementary strand of the dsDNA. This reaction is highly regulated by numerous accessary proteins in vivo. Although conventional biochemical assays have been successfully employed to examine the role of such accessory protein in vitro, kinetic analysis of intermediate formation and its progression into a final product has proven challenging due to the unstable and transient nature of the reaction intermediates. To observe these reaction steps directly in solution, fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based real-time observation systems of this reaction were established. Kinetic analysis of real-time observations shows that the DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 obeys a three-step reaction model involving the formation of a three-strand DNA intermediate, maturation of this intermediate, and the release of ssDNA from the mature intermediate. The Swi5-Sfr1 complex, an accessary protein conserved in eukaryotes, strongly enhances the second and third steps of this reaction. The FRET-based assays presented here enable us to uncover the molecular mechanisms through which recombination accessary proteins stimulate the DNA strand exchange activity of Rad51. The primary goal of this protocol is to enhance the repertoire of techniques available to researchers in the field of homologous recombination, particularly those working with proteins from species other than Schizosaccharomyces pombe, so that the evolutionary conservation of the findings presented herein can be determined.

Fluorescence resonance energy transfer-based real-time observation systems of the DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 were developed. Using the protocols presented here, we are able to detect the formation of reaction intermediates and their conversion into products, while also analyzing the enzymatic kinetics of the reaction.

Osservazione in tempo reale della DNA Strand Exchange reazione mediata da Rad51

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer structural and functional advantages to mitochondria. SCs have been identified in many species, from yeast to mammal, and an increasing number of studies report disruption of their organization in genetic and acquired human diseases. As a result, an increasing number of laboratories are interested in analyzing SCs, which can be methodologically challenging. This article presents an optimized protocol that combines the advantages of Blue- and Clear-Native PAGE methods to resolve and analyze SCs in a time-effective manner. With this hybrid CN/BN-PAGE method, mitochondrial SCs extracted with optimal amounts of the mild detergent digitonin are exposed briefly to the anionic dye Coomassie Blue (CB) at the beginning of the electrophoresis, without exposure to other detergents. This short exposure to CB allows to separate and resolve SCs as effectively as with traditional BN-PAGE methods, while avoiding the negative impact of high CB levels on in-gel activity assays, and labile protein-protein interactions within SCs. With this protocol it is thus possible to combine precise and rapid in gel activity measurements with analytical techniques involving 2D electrophoresis, immuno-detection, and/or proteomics for advanced analysis of SCs.

Here we present a protocol to extract, resolve and identify mitochondrial supercomplexes which minimizes exposure to detergents and Coomassie Blue. This protocol offers an optimal balance between resolution, and preservation of enzyme activities, while minimizing the risk of losing labile protein-protein interactions.

Elettroforesi ibrida trasparente/blu nativa per la separazione e l'analisi dei supercomplessi di catene respiratorie mitocondriali

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed complexes. The latter can be elegantly resolved according to molecular size using native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Coupling of such separations to sensitive mass spectrometry (BN-MS) has been well-established and theoretically allows for exhaustive assessment of the extractable complexome in biological samples. However, this approach is rather laborious and provides limited complex size resolution and sensitivity. Also, its application has remained restricted to abundant mitochondrial and plastid proteins. Thus, for a majority of proteins, information regarding integration into stable protein complexes is still lacking. Presented here is an optimized approach for complexome profiling comprising preparative-scale BN-PAGE separation, sub-millimeter sampling of broad gel lanes by cryomicrotome slicing, and mass spectrometric analysis with label-free protein quantification. The procedures and tools for critical steps are described in detail. As an application, the report describes complexome analysis of a solubilized endosome-enriched membrane fraction from mouse kidneys, with 2,545 proteins profiled in total. The results demonstrate identification of uniform, low-abundance membrane proteins such as intracellular ion channels as well as high resolution, complex protein assembly patterns, including glycosylation isoforms. The results are in agreement with independent biochemical analyses. In summary, this methodology allows for comprehensive and unbiased identification of protein (super)complexes and their subunit composition, providing a basis for investigating stoichiometry, assembly, and interaction dynamics of protein complexes in any biological system.

A versatile cryoslicing BN-MS protocol using a microtome is presented for high-resolution complexome profiling.

Profilazione complesso ad alta risoluzione di Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the cell by controlling protein stability, activity, interactions, and intracellular localization. They enable the cell to respond to signals and to adapt to changes in its environment. Alterations within these mechanisms can lead to severe pathological situations such as neurodegenerative diseases and cancers. The aim of the technique described here is to establish ub/ubls dependent PTMs profiles, rapidly and accurately, from cultured cell lines. The comparison of different profiles obtained from different conditions allows the identification of specific alterations, such as those induced by a treatment for example. Lentiviral mediated cell transduction is performed to create stable cell lines expressing a two-tags (6His and Flag) version of the modifier (ubiquitin or a ubl such as SUMO1 or Nedd8). These tags permit the purification of ubiquitin and therefore of ubiquitinated proteins from the cells. This is done through a two-step purification process: The first one is performed in denaturing conditions using the 6His tag, and the second one in native conditions using the Flag tag. This leads to a highly specific and pure isolation of modified proteins which are subsequently identified and semi-quantified by liquid chromatography followed by tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technology. Easy informatics analysis of MS data using Excel software enables the establishment of PTM profiles by eliminating background signals. These profiles are compared between each condition in order to identify specific alterations which will then be studied more specifically, starting with their validation by standard biochemistry techniques.

This protocol aims at establishing ubiquitin (Ub) and ubiquitin-likes (Ubls) specific proteomes in order to identify alterations of these kind of post-translational modifications (PTMs), associated with a specific condition such as a treatment or a phenotype.

Profilazione delle modifiche post-traduzionali dipendenti da Ubiquitin e Ubiquitine e identificazione di alterazioni significative

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent attachment of 76 amino acid ubiquitin modifiers to a target protein, depending on the length and topology of the polyubiquitin chain, can result in different outcomes ranging from protein degradation to changes in the localization and/or activity of modified protein. Three enzymes sequentially catalyze the ubiquitination process: E1 ubiquitin-activating enzyme, E2 ubiquitin-conjugating enzyme, and E3 ubiquitin ligase. E3 ubiquitin ligase determines substrate specificity and, therefore, represents a very interesting study subject. Here we present a comprehensive approach to study the relationship between the enzymatic activity and function of the RING-type E3 ubiquitin ligase. This four-step protocol describes 1) how to generate an E3 ligase deficient mutant through site-directed mutagenesis targeted at the conserved RING domain; 2&#8211;3) how to examine the ubiquitination activity both in vitro and in planta; 4) how to link those biochemical analysis to the biological significance of the tested protein. Generation of an E3 ligase-deficient mutant that still interacts with its substrate but no longer ubiquitinates it for degradation facilitates the testing of enzyme-substrate interactions in vivo. Furthermore, the mutation in the conserved RING domain often confers a dominant negative phenotype that can be utilized in functional knockout studies as an alternative approach to an RNA-interference approach. Our methods were optimized to investigate the biological role of the plant parasitic nematode effector RHA1B, which hijacks the host ubiquitination system in plant cells to promote parasitism. With slight modification of the in vivo expression system, this protocol can be applied to the analysis of any RING-type E3 ligase regardless of its origins.

The goal of this manuscript is to present an outline for the comprehensive biochemical and functional studies of the RING-type E3 ubiquitin ligases. This multistep pipeline, with detailed protocols, validates an enzymatic activity of the tested protein and demonstrates how to link the activity to function.

Caratterizzazione funzionale di RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro e In Planta

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk population methods (Northern blot, PCR, and RNAseq) that measure mRNA levels lack the ability to provide information on cell-to-cell variation in responses. Precise single cell and allelic visualization and quantification is possible via single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH). RNA-FISH is performed by hybridizing target RNAs with labeled oligonucleotide probes. These can be imaged in medium/high throughput modalities, and, through image analysis pipelines, provide quantitative data on both mature and nascent RNAs, all at the single cell level. The fixation, permeabilization, hybridization and imaging steps have been optimized in the lab over many years using the model system described herein, which results in successful and robust single cell analysis of smFISH labeling. The main goal with sample preparation and processing is to produce high quality images characterized by a high signal-to-noise ratio to reduce false positives and provide data that are more accurate. Here, we present a protocol describing the pipeline from sample preparation to data analysis in conjunction with suggestions and optimization steps to tailor to specific samples.&#160;

Single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a method to accurately quantify levels and localization of specific RNAs at the single cell level. Here, we report our validated lab protocols for wet-bench processing, imaging and image analysis for single cell quantification of specific RNAs.

Analisi a singola cellula di alleli trascrizionalmente attivi mediante FISH a singola molecola

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation

Analysis of plasma lipoproteins and apolipoproteins is an essential part for the diagnosis of dyslipidemia and studies of lipid metabolism and atherosclerosis. Although there are several methods for analyzing plasma lipoproteins, ultracentrifugation is still one of the most popular and reliable methods. Because of its intact separation procedure, the lipoprotein fractions isolated by this method can be used for analysis of lipoproteins, apolipoproteins, proteomes, and functional study of lipoproteins with cultured cells in vitro. Here, we provide a detailed protocol to isolate seven lipoprotein fractions including VLDL (d&#60;1.006 g/mL), IDL (d=1.02 g/mL), LDLs (d=1.04 and 1.06 g/mL), HDLs (d=1.08, 1.10, and 1.21 g/mL) from rabbit plasma using sequential floating ultracentrifugation. In addition, we introduce the readers how to analyze apolipoproteins such as apoA-I, apoB, and apoE by SDS-PAGE and Western blotting and show representative results of lipoprotein and apolipoprotein profiles using hyperlipidemic rabbit models. This method can become a standard protocol for both clinicians and basic scientists to analyze lipoprotein functions.

Several methods have been used for analyzing plasma lipoproteins; however, ultracentrifugation is still one of the most popular and reliable methods. Here, we describe a method regarding how to isolate lipoproteins from plasma using sequential density ultracentrifugation and how to analyze the apolipoproteins for both diagnostic and research purposes.

Isolamento e analisi delle lipoproteine plasmatiche mediante ultracentrifugazione

Analysis of plasma lipoproteins and apolipoproteins is an essential part for the diagnosis of dyslipidemia and studies of lipid metabolism and ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan structure are fairly conserved across all bacteria, there is also considerable variation between Gram-positives/negatives and between species. In addition, there are numerous known variations, modifications, or adaptations to the peptidoglycan that can occur within a bacterial species in response to growth phase and/or environmental stimuli. These variations produce a highly dynamic structure that is known to participate in many cellular functions, including growth/division, antibiotic resistance, and host defense avoidance. To understand the variation within peptidoglycan, the overall structure must be broken down into its constitutive parts (known as muropeptides) and assessed for overall cellular composition. Peptidoglycomics uses advanced mass spectrometry combined with high-powered bioinformatic data analysis to examine peptidoglycan composition in fine detail. The following protocol describes the purification of peptidoglycan from bacterial cultures, the acquisition of muropeptide intensity data through a liquid chromatograph&#8212;mass spectrometer, and the differential analysis of peptidoglycan composition using bioinformatics.

This protocol covers a detailed analysis of peptidoglycan composition using liquid chromatography mass spectrometry coupled with advanced feature extraction and bioinformatic analysis software.

Methods Article

Analisi della catena Ubiquitin mediante monitoraggio parallelo della reazione