Questo protocollo è importante perché è semplice da eseguire e alla portata di qualsiasi laboratorio. Questo protocollo consente l'isolamento di peptidi HLA o MHC di tipo I o di tipo II da campioni umani o di topo. Questo metodo può affrontare questioni scientifiche relative a tutte le aree di ricerca che coinvolgono il sistema immunitario, sia nel cancro, virologia o malattie autoimmuni.
Questo protocollo è stato costruito per essere accessibile a chiunque lavori in un laboratorio di ricerca. Basta seguire i passaggi. Iniziare ad attivare le perle di bromuro di cianogeno sefarosio pesando 80 milligrammi per campione e trasferendole in un tubo conico da 15 millilitri.
Aggiungere cinque millilitri di acido cloridrico monomillolare. Pipettare su e giù cinque volte per facilitare la risospensione delle perline essiccate, quindi riempire il tubo conico con ulteriori 8,5 millilitri di acido cloridrico monomillimolare. Ruotare le perline a 20 RPM per 30 minuti a temperatura ambiente utilizzando un dispositivo rotatore.
Centrifugare le perline a 200x G per due minuti a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante per aspirazione. Aggiungere 500 microlitri di buffer di accoppiamento alla tavolozza delle perline, quindi trasferire la sospensione del tallone in un nuovo tubo centrifugo da due millilitri e metterlo da parte. Per accoppiare gli anticorpi a queste perle, aggiungere due milligrammi dell'anticorpo selezionato in un nuovo tubo microcentrifuga da due millilitri e portare il volume a un millilitro con una soluzione tampone di accoppiamento per ottenere una concentrazione finale di due milligrammi per millilitro.
Trasferire la soluzione di perline precedentemente preparata e aggiungerla alla soluzione anticorpale. Quindi, ruotare il tubo della microcentrifuga a 20 RPM per 120 minuti utilizzando un dispositivo rotatore, centrifugare le perline, quindi rimuovere il surnatante come descritto in precedenza. Ora inizia a bloccare e lavare le perline aggiungendo prima un millilitro di glicina 0,2 molare al tubo microcentrifuga contenente le perle accoppiate agli anticorpi e ruotando a 20 RPM per 60 minuti a temperatura ambiente utilizzando un dispositivo rotatore.
Dopo aver centrifugato e rimosso il surnatante, lavare le perline con un millilitro PBS, rimuovere il surnatante mediante centrifugazione e conservare le perline in un millilitro di PBS a quattro gradi Celsius fino all'uso. Per isolare i peptidi MHC di classe I o II, scongelare una tavolozza congelata di 100 milioni di cellule riscaldando il fondo del tubo con un palmo. Aggiungere 500 microlitri di PBS alla tavolozza e pipettare su e giù fino a quando la sospensione è omogenea.
Trasferire la sospensione in un nuovo tubo microcentrifuga da due millilitri e aggiungere un volume uguale di tampone di lisi cellulare. Ruotare a 10 RPM per 60 minuti a quattro gradi Celsius utilizzando un dispositivo rotatore. Centrifugare il lisato cellulare a 18.000x G per 20 minuti a quattro gradi Celsius con freno completo e trasferire il surnatante in un nuovo tubo microcentrifuga da due millilitri.
Recuperare le perle accoppiate agli anticorpi mediante centrifugazione e rimozione del surnatante. Quindi, trasferire il surnatante di lisato cellulare alle perle accoppiate agli anticorpi e incubare a 10 RPM per 14-18 ore durante la notte a quattro gradi Celsius utilizzando un dispositivo rotatore. Il secondo giorno, rimuovere il coperchio inferiore della colonna in polipropilene, posizionare la colonna sul rack della colonna in polipropilene e installare un contenitore vuoto sotto per raccogliere il flusso attraverso.
Ora risciacquare la colonna di polipropilene con 10 millilitri di tampone A e lasciarla drenare per gravità. Se la velocità di flusso dell'eluizione del liquido è troppo lenta, tagliare ulteriormente la punta inferiore della colonna di polipropilene. Misurare e raccogliere la miscela di perline/lisato e trasferirla nella colonna di polipropilene.
Lasciare che la miscela liquida eluisca per gravità. Facoltativamente, raccogliere e congelare 20 microlitri di aliquote per western blotting. Ora lavare le perline trattenute nella colonna di polipropilene aggiungendo 10 millilitri di tampone A e lasciandolo eluire per gravità.
Rimuovere la colonna in polipropilene dal rack e posizionarla sulla parte superiore di un nuovo tubo microcentrifuga da due millilitri, tenendo la colonna e il tubo insieme con la mano. Aggiungere 300 microlitri di 1%TFA alla colonna di polipropilene e mescolare le perline convogliando su e giù cinque volte. Quindi, trasferire l'eluato in un nuovo tubo microcentrifuga da due millilitri.
Per la dissalazione e l'eluizione dei peptidi MHC, aggiungere 200 microlitri di metanolo sopra la colonna C-18 e centrifugare a 1.546x G per tre minuti per scartare il flusso attraverso. Aggiungere 200 microlitri di acetonitrile all'80% in 0,1% TFA sopra la colonna C-18 e di nuovo centrifugare per scartare il flusso attraverso. Quindi, aggiungere 200 microlitri dello 0,1% di TFA, scartando il flusso attraverso la centrifugazione.
Infine, caricare 200 microlitri dei complessi peptidici MHC sulla parte superiore della colonna C-18, scartare il flusso attraverso la centrifugazione e ripetere fino a quando il volume completo non viene caricato. Quindi, aggiungere 200 microlitri dello 0,1% di TFA, centrifugare per scartare il flusso attraverso, trasferire la colonna C-18 in un nuovo tubo microcentrifuga da due millilitri ed eluire peptidi MHC aggiungendo 150 microlitri di acetonitrile al 28% in 0,1% TFA. Dopo la centrifugazione, raccogliere il flusso attraverso in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri.
Ripetere il processo di eluizione due volte per un volume totale di 450 microlitri e congelare a meno 20 gradi Celsius fino all'analisi da parte di LC-MS-MS. Utilizzare questi peptidi purificati per l'identificazione di peptidi MHC di classe I e II in uno spettrometro di massa. L'efficienza di legame delle perline è stata illustrata da una significativa diminuzione dell'intensità di colorazione del segnale delle catene leggere e pesanti quando le perle sono legate covalentemente alle perle CNBr, rispetto all'anticorpo prima dell'accoppiamento.
L'isolamento dei complessi peptidici MHC dopo l'eluizione acida è stato confermato dal forte segnale di rilevamento dei complessi peptidici MHC utilizzando anticorpi a catena pesante anti-HAL-ABC. È stata inoltre stimata la riproducibilità intra e interindividuale dei risultati utilizzando il protocollo corrente. Il coefficiente medio di variazione per il numero di peptidi rilevati in tre diverse repliche biologiche era piccolo, che variava dall'1,9 all'11% Tuttavia, l'identità dei peptidi variava considerevolmente e la proporzione di peptidi rilevati in modo riproducibile su tre repliche biologiche variava dal 39% al 63% Le mappe di calore generate mostravano la forza di legame MHC prevista dei peptidi identificati.
Per i peptidi MHC di classe I e II del topo, i leganti forti o deboli predicati erano rispettivamente dell'89 e dell'87%. Per i peptidi umani HLA di classe I e II, i leganti forti o deboli predicati erano rispettivamente del 97 e del 70%. Sono stati generati anche i motivi di legame peptidico del topo e dell'uomo per i peptidi LHC di classe I e classe II.
Prima dell'ottimizzazione di questo protocollo, l'isolamento dei peptidi murini MHC di classe I e II era molto più difficile. Questo protocollo ottimizzato faciliterà l'isolamento dei peptidi murini MHC di classe I e II da modelli murini murini, ad esempio, abitualmente utilizzati per la convalida di molti studi diversi relativi alla malattia.
