Le iniezioni a getto d'acqua di componenti attivi, come liquidi, nanoparticelle, microparticelle, farmaci incapsulati o persino cellule viventi possono essere applicate in modo molto più preciso rispetto alle iniezioni di ago in diversi tessuti presi di mira. Gli approcci minimamente invasivi richiedono una localizzazione precisa del farmaco in strati predeterminati del tessuto bersaglio preselezionando le pressioni di iniezione. Il nostro obiettivo attuale è la terapia cellulare per l'incontinenza urinaria.
Tuttavia, questa tecnica è già stata estesa alla rigenerazione del tessuto muscolare infetto dopo gravi attacchi di cuore. Allo stato attuale, la tecnica può essere applicata solo da ricercatori esperti o medici autorizzati in studi pre-clinici. Non è destinato ad essere utilizzato nelle procedure di laboratorio di routine in quanto è sviluppato per scopi clinici futuri.
Per iniziare, posizionare l'uretra con la vescica di collegamento sezionata da un maiale femmina adulto su una spugna che imita l'elasticità del pavimento pelvico inferiore. Quindi utilizzando la vescica, determinare l'orientamento dell'uretra. Ciò è possibile grazie alla localizzazione dell'uretere e dei tre legamenti, che fissano la vescica nella cavità addominale e pelvica.
Dopo aver orientato correttamente l'uretra, tagliarla longitudinalmente sul lato dorsale con l'aiuto di un catetere. Dopo aver regolato la densità cellulare delle cellule stromali derivate dal tessuto adiposo suino a 2,4 volte 10-sesta cellula per millilitro, etichettare le cellule con una membrana fluorescente verde permeabile alla macchia di cellule vive, quindi aspirare la sospensione cellulare con la siringa e applicare l'ago per iniezione citoscopica Williams. Quindi, tenere l'ago poco sopra i due millilitri di terreno di crescita in un tubo di centrifugazione da 15 millilitri o inserire l'ago nel tessuto uretrale aperto.
In entrambi i casi, iniettare manualmente 250 microlitri della sospensione cellulare. Cellule iniettate nell'uretra cadaverica da una cupola di iniezione. Raccogliere le cellule iniettate nel mezzo direttamente mediante centrifugazione.
Per le cellule iniettate nell'uretra cadaverica, aspirarle fuori dalla cupola di iniezione con un ago calibro 18 applicato su una siringa. Trasferire le celle aspirate in un tubo di centrifugazione e pellettarle mediante centrifugazione. Sospendere entrambi i pellet di cella in quattro millilitri di terreno di crescita.
Per determinare la resa e la vitalità delle cellule, mescolare accuratamente 20 della sospensione cellulare con 20 microlitri di tripano blu. Quindi riempire 10 microlitri di questa miscela in ogni camera dell'emocitometro. Al microscopio contate le cellule in tutti e quattro i quadrati d'angolo.
Conta i globuli bianchi non macchiati come cellule vitali e le cellule macchiate di blu come cellule morte, quindi calcola il numero di cellule per millilitro. Per le iniezioni tramite il getto d'acqua, regolare la densità delle cellule stromali derivate dal tessuto adiposo suino a sei volte da 10 a sei cellule per millilitro. Etichettarli come dimostrato in precedenza e riempire la sospensione cellulare nell'unità di dosaggio del dispositivo a getto d'acqua senza ago.
Quindi tenere l'ugello di iniezione poco sopra i due millilitri di terreno di crescita in un tubo di centrifugazione da 15 millilitri o poco sopra il tessuto uretrale aperto. In entrambi i casi, iniettare 100 microlitri della sospensione cellulare. Utilizzare alta pressione per la penetrazione dei tessuti seguita da una fase di bassa pressione per le iniezioni cellulari.
Le cellule iniettate nell'uretra cadaverica formano una cupola di iniezione. Raccogliere le cellule iniettate nel mezzo direttamente mediante centrifugazione. Per le cellule iniettate nell'uretra cadaverica, aspirarle fuori dalla cupola di iniezione.
Trasferire le celle aspirate in un tubo di centrifugazione e pellettarle utilizzando la centrifugazione come dimostrato in precedenza. Dopo la centrifugazione, risospesare entrambi i pellet in quattro millilitri di mezzi di crescita. Semina le cellule recuperate dopo le iniezioni in piatti di coltura tissutale ad una densità di cinque volte 10 alle quinte cellule per piatto.
Dopo un'incubazione di tre ore a 37 gradi Celsius, e subito prima della misurazione AFM, sostituire il mezzo di crescita con tre millilitri di mezzi L-15 di Leibovitz senza L-glutammina. Per misurare l'elasticità delle singole cellule, identificare visivamente una cellula e concentrarsi su di essa. Quindi posizionare il mouse del computer al centro della cella e per migliorare la precisione delle misurazioni, posizionare la punta AFM direttamente sopra il nucleo della cella.
Quindi, concentrati sul cantilever e spostalo sul mouse del computer. Quindi iniziare la misurazione con run e misurare almeno 50 celle. Viene utilizzato il parametro del set point ottenuto dalla calibrazione del cantilever e una cella viene misurata tre volte.
La vitalità delle cellule erogate attraverso l'ago Williams era superiore alle iniezioni dal getto d'acqua utilizzando le impostazioni E60-10. La valutazione biomeccanica delle iniezioni nel fluido di cattura ha rivelato che le iniezioni con ago Williams non mostravano differenze significative nei moduli elastici rispetto ai controlli, mentre le iniezioni a getto d'acqua riducevano significativamente i moduli elastici cellulari dal 40 al 50% Allo stesso modo, nei campioni di tessuto uretrale cadaverico, le iniezioni di ago Williams non producevano differenze significative nei moduli elastici cellulari rispetto ai controlli. Tuttavia, una riduzione significativa del 51% è stata osservata dopo iniezioni a getto d'acqua.
Bisogna solo assicurarsi che le iniezioni dell'ago non penetrino completamente nel tessuto che sta infliggendo lesioni. Con il getto d'acqua, si deve solo posizionare il dispositivo nella posizione corretta nell'area di iniezione mentre il resto viene eseguito automaticamente dal dispositivo stesso. Poiché il dispositivo a getto d'acqua è stato sviluppato per abbinarsi e adattarsi ai dispositivi endoscopici, è possibile utilizzare le applicazioni a getto d'acqua per qualsiasi sito del corpo che può essere raggiunto da queste tecnologie cistoscopiche o endoscopiche per rigenerare i tessuti e fare il lavoro di riparazione.
