L'obiettivo di questo protocollo è quello di rilevare metaboliti fenolici nel plasma mediante un metodo UPLC-MS/MS semi-mirato. Le proteine plasmatiche sono state precipitate con etanolo e campioni concentrati e nuovamente sospese nella fase mobile, prima dell'iniezione nell'apparecchiatura UPLC. I composti sono stati identificati utilizzando una libreria semi mirata assemblata in laboratorio, utilizzando il gestore PCDL per la metabolomica, il software e diversi database online gratuiti.
Abbiamo implementato un intervento nutrizionale con un muffin e una bevanda formulata con farina di semi di brosimum alicastro. Alla fine dell'intervento, lo stato nutrizionale e sarcopenico dei partecipanti è stato migliorato e il contenuto fenolico totale del plasma è stato aumentato. Ma dobbiamo identificare quali composti fenolici sono stati assorbiti e hanno contribuito all'effetto positivo.
L'identificazione e la quantificazione dei composti fenolici che vengono assorbiti dopo il consumo di alimenti ricchi di questi antiossidanti è un compito difficile ma necessario, se si vuole dimostrare l'attività biologica di questi fitochimici. La biodisponibilità della maggior parte dei componenti fenolici è bassa, inoltre meno del 5% di essi entra senza trasformazione strutturale in plasma. La maggior parte passa attraverso diverse biotrasformazioni, come la metilazione, la solfonazione o la glucuronidazione.
Una vasta gamma di studi ha identificato i metaboliti più comuni nei biofluidi da UPLC-MS e UPLC-MS/MS. Tuttavia, gran parte del metabolita batterico non è segnalato per la mancanza di database che contengono le loro informazioni complete. L'identificazione dei metaboliti è complicata dal costo e dalla disponibilità commerciale degli standard dei metaboliti.
Pertanto, la strategia migliore può essere l'analisi dei metaboliti MS/MS non mirata o semi-mirata. Questa analisi si basa sull'uso di informazioni sulle caratteristiche molecolari, massa esatta del rapporto massa/carica monoisotopica, distribuzione isotopica e modello di frammentazione. Determinare l'identità chimica e confrontarla con i database online disponibili gratuitamente che contengono metaboliti polifenolici identificati nei biofluidi dopo il consumo di diete ricche di polifenoli.
Nel presente studio, abbiamo sviluppato un metodo UPLC-MS/MS semi-mirato per analizzare i campioni di plasma di un gruppo di persone anziane coinvolte in un intervento nutrizionale. Conservare i campioni di plasma a meno 80 gradi Celsius fino all'analisi. Scongelare i campioni di plasma a temperatura ambiente per 15 minuti o a 37 gradi Celsius per cinque minuti.
Posizionare 200 microlitri di campione di plasma in un microtubo di due millimetri e mescolare con 1000 microlitri di etanolo puro. Campione di plasma Vortex per 30 secondi. Campione di centrifuga a 6.580 forza centrifuga per cinque minuti.
Dopo la centrifugazione, raccogliere il surnatante con una micropipetta o una pipetta Pasteur e posizionarlo in un nuovo microtubo. Riserva il surnatante. Mescolare un pellet con 1000 microlitri di etanolo puro, vertice per 30 secondi, quindi centrifugare alle stesse condizioni.
Raccogliere il surnatante e mescolare con il primo surnatante. Rimuovere l'etanolo dal campione utilizzando azoto puro a 135 psi. Tenere l'ago a un centimetro di distanza dalla parte superiore del microtubo per evitare la perdita del campione e il lavaggio fino a quando un campione è asciutto.
Resuspend campioni secchi in 100 microlitri di uno è a una miscela di acetonitrile con acqua. Filtrare attraverso una membrana di siringa di nylon 45 micro direttamente in un micro inserto per fiala HPLC Iniettare tre microlitri di campione su UPLC dotato di una colonna di fase inversa C 18. Impostare la temperatura dell'autocampionatore a 20 gradi Celsius e il termostato a colonna a 25 gradi Celsius.
Iniettare ogni campione in triplice copia. Utilizzare lo 0,1% di acido formico in acqua come solvente A e il 100% di acetonitrile come solvente B.Impostare la portata a 0,4 millimetri al minuto e un programma di gradiente come segue, da zero a un minuto 10% B, da uno a quattro minuti 30% B, da quattro a sei minuti 38% B, da sei a otto minuti 60% B, da otto a 8,5 minuti 60%B, Da 8,5 a nove minuti 10%B. Impostare lo spettrometro di massa in modalità negativa ionizzazione.
Utilizzare l'azoto come gas di essiccazione a 300 gradi Celsius e la portata a 13 litri al minuto. Impostare la pressione del nebulizzatore a 30 psi. Impostare una tensione capillare a 4.000 volt, una tensione frammentaria a 175 volt e una tensione Skimmer a 65 volt.
Scansiona le masse tra 100 e 1100 m/z e per la spettrometria di massa, scansiona masse comprese tra 50 e 1000 m/z. Impostare l'acquisizione dati in modalità Auto MS/MS. Utilizzare la seguente massa di riferimento, 119.036 e 966.0007.
Ricerca di composti fenolici, metaboliti fenolici e altri composti di interesse per la letteratura scientifica. Aprire il software di gestione del database incluso nel sistema UPLC. Selezionare file, quindi selezionare nuova libreria composta di database personali, PCDL.
Quindi selezionare, creare un nuovo PCDL. Selezionare il tipo di metabolomica PCDL LC/MS. Impostare il nome per PCDL.
Quindi seleziona crea. Nella barra degli strumenti, selezionare PCDL e quindi l'opzione Consenti modifica. Quindi fare clic sul pulsante Trova composti.
I composti possono essere aggiunti alla libreria personale in due modi, in primo luogo copiandoli dalla libreria generale dello strumento. Per fare ciò, aprire il database degli strumenti esistente incluso nella gestione dei dati finora. Fare clic sul pulsante Trova composti.
Nell'opzione di ricerca singola, inserisci i criteri di ricerca composti per trovare il composto di interesse. Nella tabella dei risultati composti, selezionare il composto di interesse. Per selezionare più composti, fare clic sul primo composto, quindi tenere premuto CTRL e quindi fare clic su ogni composto di interesse.
Quindi, fare clic con il pulsante destro del mouse su tutti i composti evidenziati e selezionare Aggiungi a PCDL. Nella nuova finestra, cercare e selezionare il file di database personale specializzato. Contrassegnare la casella include spettri per composto, se presente.
Fare clic sul pulsante Aggiungi. Nella finestra di dialogo Nuovo selezionare Sì per controllare i nuovi composti aggiunti. Selezionare No per continuare a cercare altri composti di interesse.
In secondo luogo, nuovi composti possono essere aggiunti manualmente se non sono disponibili nella libreria generale dello strumento. Per questo aprire, il database personale specializzato. Una volta aperto, selezionare PCDL, quindi l'opzione Consenti modifica.
Selezionate l'opzione Modifica composti (Edit Compounds). Fare clic sul pulsante Aggiungi nuovo. Nella sezione superiore della finestra, completare le informazioni del nuovo composto.
Inserisci la formula, il nome, il nome IUPAC, il numero CAS, l'ID Chemspider e altri identificatori. Utilizzando le informazioni disponibili nelle librerie online gratuite, Chemspider, PubChem e Phenol Explorer per compilare le informazioni del nuovo composto di interesse. Una volta terminato, fare clic sul pulsante Salva come nuovo per salvare le nuove informazioni composte nel database personale specializzato.
Ripeti il processo con tutti i composti di interesse per completare il database personale specializzato. Utilizzare il software di gestione qualitativa dello strumento per identificare composti fenolici e metaboliti fenolici. Aprire il file di esempio.
Nel pannello Cromatogramma, selezionare Definisci cromatogrammi ed estrarre il cromatogramma ionico totale TIC, il cromatogramma ionico estratto di MS EIC e EIC di MS/MS. Selezionare l'opzione cromatogramma integrato. Nel pannello Trova composti, selezionate trova per opzioni formula.
Nella nuova finestra selezionare l'origine della formula e quindi l'opzione della libreria di barre del database. Trova il database personale creato in precedenza e fai clic su Apri. Selezionate l'opzione di corrispondenza della formula e impostate una tolleranza di corrispondenza di massa di cinque parti per milione, ppm.
Selezionate l'opzione ioni negativi e selezionate solo la finestra di dialogo meno H. Nell'opzione dei risultati, contrassegnare l'EIC di estrazione, estrarre lo spettro pulito, estrarre lo spettro grezzo e includere finestre di dialogo strutturate. Selezionare l'opzione dei filtri dei risultati.
E poi segna avvertire se il punteggio è, quindi impostare la corrispondenza del punteggio su 80% Quindi contrassegnare non corrispondere se il punteggio è e impostare il punteggio su 75%Quindi fare clic su trova composti per formula per identificare i composti di interesse nel campione. Il processo passo passo per l'identificazione dei metaboliti fenolici attraverso l'analisi semi-mirata UPLC MS/MS di campioni plasmatici è mostrato nella figura seguente. In primo luogo, il cromatogramma ionico totale è stato ottenuto utilizzando un database PCDL auto-creato che conteneva 645 composti fenolici e i loro metaboliti, ottenuti da database online gratuiti.
Successivamente, sono stati ottenuti il cromatogramma ionico estratto e il modello di frammentazione, o gli ioni con una massa inferiore a cinque ppm, con tolleranza di corrispondenza. Infine, la distribuzione isotopica dei picchi rilevati è stata confrontata con quella dei composti teorici. Da questa analisi, un totale di 25 composti fenolici e metaboliti sono stati identificati nei campioni di plasma.
Per valutare l'efficacia del metodo di progettazione nell'identificazione dei composti fenolici assorbiti o dei loro metaboliti, sono stati analizzati cinque campioni dei partecipanti allo studio ottenuti prima e dopo l'intervento di 30 giorni. L'abbondanza relativa di ciascun composto è stata calcolata dividendo l'area sotto la curva dopo il trattamento per AUC prima del trattamento. La tabella quattro mostra l'elenco di 12 composti fenolici che hanno mostrato un aumento del plasma dopo il consumo di 30 giorni della farina di alicastro brosimum contenente alimenti.
L'acido fenilacetico è stato trovato solo metabolita costantemente in concentrazione più elevata dopo il trattamento. La glicitina, un isoflavone glicosilato e tre acidi idrossifenilvalerici sono aumentati in tre dei cinque campioni, ma sono diminuiti negli altri due. La gomisina M2, un lignan, è stata rilevata in tre dei cinque campioni solo dopo l'intervento nutrizionale.
Gli altri composti fenolici e metaboliti sono stati trovati solo in un campione e solo dopo il trattamento. Il metodo sviluppato nel presente documento, mostra che nella maggior parte delle parti era adatto per l'obiettivo per il quale è stato creato. Il campione per trattamento era semplice ed efficace.
Sono stati raggiunti la separazione UPLC e l'identificazione semi-mirata di MS/MS dei metaboliti fenolici.
